Un’intera famiglia di lieviti Farmhouse

Pubblicato il 7 aprile 2024 sul blog di Lars Marius Garshol, l’articolo “There is a Whole Family of European Farmhouse Yeasts” ha portato alla luce una scoperta scientifica destinata a ridefinire ciò che sappiamo sulla storia della birra e sulla biodiversità del lievito. Dopo anni di raccolte, analisi genetiche e collaborazioni internazionali, è emersa un’evidenza tanto semplice quanto straordinaria: i lieviti tradizionalmente usati dai birrai contadini in diverse aree d’Europa non sono solo funzionalmente diversi dai lieviti industriali, ma costituiscono una vera e propria famiglia genetica distinta.

Dal Kveik al continente: la genesi della ricerca

Tutto ha avuto inizio con il celebre studio del 2018 sul kveik, il lievito tradizionale della Norvegia occidentale, che rivelò l’origine genetica di questa antica cultura di fermentazione. Ma subito dopo la pubblicazione, Lars Marius Garshol e i ricercatori Richard Preiss e Kristoffer Krogerus si posero una domanda cruciale: e tutti gli altri lieviti Farmhouse d’Europa?

La risposta ha richiesto sei anni di lavoro, rallentati dalla pandemia e da ostacoli logistici, ma culminati in un preprint pubblicato nel 2024 con il contributo di numerosi scienziati e appassionati di fermentazioni tradizionali. L’analisi è stata condotta principalmente nei laboratori di Escarpment Labs a Guelph, in Canada, e supportata da raccolte in campo effettuate in Norvegia, Lituania, Lettonia e Russia.

Mappa del lievito: una biodiversità inaspettata

Lo studio ha incluso campioni da cinque aree principali:

• Norvegia occidentale: il noto gruppo dei kveik.

• Norvegia orientale e settentrionale: con i ceppi detti gong e berm.

• Paesi baltici: in particolare dalla Lituania settentrionale e dalla regione lettone del Latgale.

• Russia (Ciuvascia): con tre ceppi raccolti sul Volga centrale.

• Africa occidentale (Ghana): due ceppi di lieviti agricoli, usati come riferimento comparativo.

Questa rete di raccolta ha rivelato che i lieviti di fattoria europei si raggruppano insieme, formando un’unica grande famiglia genetica, ben distinta dai classici gruppi Beer 1 e Beer 2 che finora dominavano la tassonomia del lievito da birra.

Un nuovo ramo sull’albero della vita dei lieviti

L’analisi filogenetica ha mostrato che i lieviti agricoli europei – kveik, gong, berm e baltici – condividono una base genetica comune. Essi formano una quasi-clade completamente separata, a supporto della tesi che si tratti di un nuovo gruppo naturale all’interno di Saccharomyces cerevisiae.

The family tree (you may want to click the image for a bigger version)

Questa famiglia è geograficamente strutturata:

• Il kveik rimane un gruppo separato, pur facendo parte della più ampia famiglia dei lieviti  Farmhouse.

• I lieviti gong e berm si rivelano essere lo stesso tipo genetico.

• I ceppi baltici (lituani e lettoni) si aggregano in due sottogruppi coerenti.

Una mappa altimetrica della Norvegia mostra anche come la barriera montuosa centrale del paese possa aver storicamente separato le popolazioni culturali (e quindi lieviti) di oriente e occidente.

Una quarta famiglia di lieviti

La classificazione tradizionale divideva i lieviti in:

1. Beer 1 (Ale standard)

2. Beer 2 (tipico di birre belghe e alcune lager)

3. Mixed (ibridi e contaminati)

Ora, lo studio propone l’esistenza di una quarta grande famiglia genetica: il lievito agricolo europeo, che pone interrogativi profondi sulla storia della fermentazione e sui suoi percorsi evolutivi.

E non è tutto. Analisi di tipo SNP clustering hanno mostrato sorprendenti somiglianze genetiche tra i lieviti agricoli europei e alcuni ceppi utilizzati nella fermentazione asiatica tradizionale (es. riso fermentato in Vietnam, birra di riso in Indonesia). Un collegamento inaspettato, forse retaggio di antichi scambi culturali e biologici avvenuti secoli fa.

Gli "stravaganti": anomalie genetiche e contaminazioni

Non tutti i ceppi raccolti hanno seguito il pattern atteso. Alcuni isolati lettoni, russi e norvegesi risultano geneticamente distanti dai farmhouse yeasts, raggruppandosi con i lieviti da panificazione o birra commerciale. Alcuni casi sono probabilmente dovuti a contaminazioni moderne (da panifici o homebrewing), ma resta aperta la possibilità che ci siano stati incroci naturali o sostituzioni accidentali nella trasmissione delle colture.

Un lavoro corale

La pubblicazione è frutto di un team internazionale di ricercatori, tra cui:

• Richard Preiss (Escarpment Labs)

• Kristoffer Krogerus (VTT, Finlandia)

• Barret Foster, Emine Özşahin, Mark Lubberts, George van der Merwe (Università di Guelph)

• Eugene Fletcher (Carleton University)

Fondamentali sono stati i contributi di Simonas Gutautas e Reinis Pļaviņš, che hanno raccolto la maggior parte dei ceppi baltici.

Ma, come sottolinea lo stesso Garshol, il ringraziamento più grande va a quei birrai contadini che per generazioni hanno mantenuto vive queste colture, ignari del tesoro genetico che custodivano.

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Conclusione

Questa ricerca cambia le carte in tavola, per la prima volta, abbiamo delle prove genetiche che i lieviti Farmhouse  europei non sono solo funzionalmente diversi, ma anche geneticamente unici. Una nuova famiglia, viva e attiva, ancora presente in fattorie, villaggi e birrifici di nicchia.

Le implicazioni storiche, evolutive e culturali sono immense – ma, come promette Garshol, saranno oggetto di futuri approfondimenti. Per ora, possiamo brindare alla rinascita di una tradizione millenaria che, finalmente, riceve il riconoscimento scientifico che merita.

Osservare i Lieviti al Microscopio | CondorLAB

I lieviti appartengono al regno dei funghi e sono organismi eucarioti, unicellulari. Sono stati catalogati più di mille specie di lieviti differenti, ma la maggior parte appartengono al gruppo degli ascomiceti. Inutile dire che il lievito più comunemente usato, in ambito alimentare, industriale e ricerca,  è il Saccharomyces Cerevisiae. Quest'ultimo si riproduce per gemmazione e appartiene al Phylum, degli ascomiceti.

Osservazione tramite microscopio della morfologia dei lieviti,

 con la replicazione per gemmazione.

UTILIZZARE LIEVITI KVEIK A TEMPERATURE BASSE

I lieviti kveik si sono imposti sulla scena brassicola per le temperature altissime e la velocità di fermentazione. Questi particolari lieviti non finiscono mai di sorprendere. Infatti, non sono pochi gli appassionati di birre lager che hanno deciso di provare i kveik a temperature più basse, per ottenere  birra dal profilo pulito e neutro. In questi casi il lievito viene gestito come un classico lievito ale, con uno tasso di inoculo e temperatura standard.

L'impatto del lievito 

sul pH della birra

Quasi tutti gli ingredienti svolgono un ruolo nel modulare il pH della birra, che risulta essere fondamentale durante tutto il processo fermentativo. Lo stesso vale per il lievito, dove alcuni si dimostrano più incisivi di altri, come nel caso specifico dei kveik. Generalmente i ceppi kveik abbassa il valore del pH rispetto ai classici lieviti. Questo aspetto incide sul sapore perchè un basso pH della birra è associato alla percezione di un minore corpo, nonché a un carattere del luppolo più forte. 

Questi dati presentano delle possibili soluzione come quella di utilizzare dell'acqua con un maggiore pH. Inoltre, è indispensabile evitare un pH del mosto troppo basso. In ammostamento sarebbe utile avere un pH 5,5-5,6. Questa attenta valutazione del ph può aiutare a migliorare le caratteristiche sensoriali finali della birra, non dimenticatelo. 

Gli altri parametri  indispensabili

Il tasso di inoculo in questione deve rispettare quella dei lieviti classici (0,7-1 milioni di cellule / mL / ° P), per un profilo aromatico neutro e una fermentazione rapida. Mentre, per la temperatura di fermentazione vi consiglio di stare tra i 15 e i 20 ° C o poco più.

L'ultimo aspetto riguarda i nutrienti per il lievito. Generalmente i kveik richiede almeno 180 ppm di FAN, rispetto ai lieviti lager che usano abitualmente circa il 30% in meno di FAN. Ciò significa che un mosto a bassa densità può essere insufficiente per il lievito e provocare scarse attenuazioni e aromi sgradevoli, come quelli solfurei.

Alcune precisazioni doverose sui Kveik

Parte della rubrica Farmhouse Ale

Colture di Lieviti Tradizionali

"I'm really happy to hear you want to spread the knowledge

 about true farmhouse ale"

Lars Marius Garshol, in un suo messaggio.

Questa mattina mi è stato chiesto un chiarimento sulla gestione  dei lieviti kveik, durante il processo fermentativo, avendo notato risultati contrastanti nell'utilizzo.

Premesso che le esperienze personali sono per me sacre, giuste o sbagliate che siano, ma in questo caso mi sento di fare qualche precisazione a tutela di ciò che viene riportato sui kveik. 

Se si parla di kveik (per saperne di più clicca qui) come colture miste e non certo come singoli ceppi isolati, bisogna capire che ogni riproduzione deve essere il più fedele possibile a quella originaria. Svein Arild Skjæveland è una delle persone con più campioni di kveik, tramite semplici rimborsi economici esegue spedizioni anche in Italia. Questa persona risulta un'ottima risorsa per chi volesse avere un contatto con questi lieviti, anche senza avere delle conoscenze dirette per reperire queste colture direttamente dai proprietari. La difficoltà maggiore con questi campioni risiede nella disponibilità limitata che arriva nelle vostre case, si parla di poco più di 1/2 ml di kveik.

Campioni di kveik spediti generalmente in Italia

Riprodurre una coltura da questi campioni non è facile, non si tratta di semplici starter, ci sono molteplici variabili per ottenere una riproduzione coerente con quella originaria. Proprio per questo se non si hanno le basi primarie è più facile ottenere una coltura totalmente differente da quella originaria, dunque non parliamo più di kveik ma evidentemente di tutt'altra cosa. 

Detto questo, non credo che questo aspetto sia del tutto trascurabile se la valutazione dei kveik viene fatta partendo da questi campioni. Troppe variabili in gioco per ottenere qualcosa di realmente simile alla coltura originale.

Malgrado ciò, concediamo il beneficio del dubbio. Ammesso che ci troviamo di fronte a delle esperienze con colture kveik originali (ripeto, se bene ci siano molteplici difficoltà) è utile sapere che  ogni coltura deve essere valutata singolarmente, nonostante l'ampio range di temperatura che presentano in fermentazione.

Kveik con Batteri Lattici

Ogni kveik ha una diversa temperatura di inoculo e di fermentazione, variabili da 28 °C fino ad arrivare addirittura a 43 °C. Da questi valori si può tranquillamente capire che non possiamo trattare questi lieviti come se fossero un'unica coltura. Non si fa di tutta l'erba un fascio! Per quanto riguarda la quantità di inoculo, vada per un quantitativo visivo e quantificabile in base all'esperienza. Tuttavia i gr devono avere un riferimento anche in volumi altrimenti è poco utile.

Una fermentazione ottimale con l'aggiunta di nutrienti termina generalmente in 3/4 giorni. Arrivare a 7/8 giorni per imbottigliare non fa altro che aumentare il rischio di stratificazione del lievito, trovandosi senza lievito in rifermentazione.

Nonostante ciò diverse persone mi hanno detto di aver rifermentato anche dopo 10 giorni di fermentazione con successo, senza problemi di stratificazione. La mia risposta è stata: <<sicuro di avere solo ceppi kveik?>>. Ripeto, la riproduzione iniziale di una coltura kveik deve essere eseguita in modo ottimale altrimenti stiamo valutando tutt'altra cosa.

Una corretta rifermentazione in bottiglia con queste colture avviene in 3/4 giorni, se dovesse impiegare più tempo potremmo trovarci difronte ad un campione diverso da quello iniziale. In tal caso in bottiglia non si avrebbero ceppi kveik ma altri lieviti.

L'ultima considerazione riguarda la raccolta dei kveik. Queste colture vanno raccolte come da tradizione, rigorosamente dalla parte alta o dal basso, nei tempi e nelle modalità suggeriti dai vecchi proprietari. Senza tali informazioni suggerisco di non comprare queste colture, avere una ferrari e non sapere come comportarsi non è una cosa saggia.

Se queste colture non rispondono per come dovrebbero bisogna valutare le possibili cause. Potrebbe essere anche solo un deficit di utilizzo (temperatura di fermentazione e mancanza di nutrienti) ma principalmente ritengo di ricercare il problema nelle molteplici fasi di riproduzione della coltura.

Vi saluto ricordandovi che non serve avere 50 kveik ma è sufficiente una sola coltura originale (essiccata dai proprietari) e una disponibilità adeguata, per  valutare al meglio questi straordinari lieviti.

Terreni di Coltura

Generalmente per terreni di coltura si intende una soluzione solida o liquida, contenente sostanze nutritive per la crescita e la ricerca microbica. 

Crescita su Piastra

UBA Agar modificato

Risulta una buona base per una crescita generica. Nella preparazione del terreno, l'aggiunta di birra riduce la presenza microbica favorendo quelli che si sono adattati al luppolo ed alcol. Naturalmente l'utilizzo della birra è assolutamente facoltativo e non indispensabile. 

5,5 g di terreno UBA
75 ml acqua distillata
25 ml di birra (non sgasata)

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA e acqua distillata nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la di birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare la condensa, la parte del vetrino superiore deve essere lasciata aperta. In laboratorio si fanno asciugare sotto la cassa a flusso laminare, evitando contaminazioni, mentre tra le mura di casa il rischio è molto alto. Personalmente preferisco utilizzare la cappa dello sterilizzatore (quello della chicco) con il Bunsen, con il quale non ho riscontrato problemi di contaminazione, solo in due singole occasioni dove avevo commesso errori precedenti.

Terreno Alternativo

Sabouraud Agar

Questo terreno risulta un'ottima alternativa all' UBA Agar modificato, per una crescita microbica generica.

20 gr di Destrosio

10 g di Agar

5 g di Bacto Peptone

pH di 5,6
Acqua distillata

Queste quantità sono per 500 ml

Diversamente se si vuole avere un approccio più casalingo verso la preparazione e gli stessi ingredienti, il libro Handbook of Microbiological Media di Ronald M. Atlas ci regala buone alternative molto economiche. Questo testo include differenti ricette che possono essere realizzate tranquillamente tra le mura di casa.

Terreno Alternativo

Potato Dextrose Agar

perfetto per coltivare qualsiasi cosa

Patate 300 gr

Glucosio o Saccarosio (zucchero da tavola) 20 gr

Agar 15 gr

Preparazione: tagliare le patate a dadini e metterle in 500 ml di acqua bollente, per 30 minuti. Tramite una garza il composto viene  filtrato, regolando il volume  su un litro con acqua distillata/deionizzata. Successivamente serve mescolare accuratamente aggiungendo l'agar al composto. Riscaldare il tutto a fuoco lento, portando ad ebollizione, aggiungendo 20 gr di glucosio e mescolando accuratamente. Passaggio in autoclave per 15 minuti a (15 psi di pressione) a 121 °C. Terminato questo passaggio, versare il Potato Dextrose Agarin nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Una volta scelti i campioni migliori, le probabilità di avere diversi ceppi di lievito, muffe e batteri, sono considerevoli. Dunque, per cercare di isolare i diversi microrganismi occorre utilizzare specifiche piastre di Petri e agar.

Crescita su Piastra

Terreni Selettivi

Questi particolari terreni favoriscono la crescita solo di specifici microrganismi, grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. Questi fattori vengono chiamati sostanze inibenti,  come ad esempio gli antibiotici. Detto questo, per isolare i diversi microrganismi presenti nei campioni iniziali, occorre avere o creare dei terreni selettivi. Un argomento sicuramente molto interessante con molteplici soluzioni, dettate principalmente dalle pratiche che più si adatta meglio alle proprie esigenze. Personalmente ho deciso di iniziare con queste differenti ricette di terreni selettivi, evitando l'acquisto di un terreno già bello e pronto.

Test sui Lieviti

Sabouraud Agar con Cloramfenicolo

Questo terreno risulta ottimo per una crescita dei lieviti.

Partendo dal terreno Sabouraud Agar ho aggiunto 0,25 gr di Cloramfenicolo, un forte antibiotico antimicrobico progettato per uccidere i batteri Gram + e Gram −.

MYPG + CuSO4 medium

utile a differenziare i Saccharomyces dai ceppi selvatici di Saccharomyces

1,5 gr di estratto di malto

1,5 gr di estratto di lievito

5,0 gr di glucosio

2,5 gr di Bacto Peptone

0,156 gr di CuSO4 - 5 H2O

pH di 6,2

Queste quantità sono per 500 ml

Il terzo media differenziale che ho usato era il media CuSO4 MYPG. Solfato di rame viene generalmente utilizzato per differenziare tra Saccharomyces e ceppi selvatici di Saccharomyces , non Brettanomyces. Anche se, Chad Yakobson di Crooked Stave ha avuto un po 'di fortuna con la crescita di Brett su lastre di CuSO4.

Test sui Brettanomyces

Brettanomyces Agar

fa crescere specificatamente le specie Brettanomyces

5,0 gr di destrosio

2,5 gr di Bacto-peptone

1,5 gr di estratto di malto

1,5 gr di estratto di lievito

1,5 gr di base azotata di lievito (YNB)

0,5 gr di cloramfenicolo

0,011 gr di verde di bromocresolo

0,01 gr di tiamina

0,05 gr di acido p-cumarico

Cicloesimide a 0,01 gr / L

10 g di Agar

Queste quantità sono per 500 ml

Infine ho realizzato Brettanomyces Agar . Ho trovato questa ricetta nel manuale dei lieviti alimentari . Questa formulazione fa crescere specificatamente le specie Brettanomyces . È interessante notare che ho aggiunto l'acido p-cumarico (per gentile concessione della Brooklyn Brewery). Questa molecola viene convertita in 4-etilfenolo da Brettanomyces e produce il classico odore di Brett: coperta di cavallo, aia e mousy. Le colonie possono essere identificate dall'odore.

Test sui Batteri

UBA Agar modificato con Cicloesimide

L'aggiunta di con Cicloesimide, al terreno UBA Agar modificato, agevola l'eliminazione dei lieviti presenti nel campione, favorendo una migliore ricerca sulle contaminazioni batteriche. 

5,5 g di terreno UBA

75 ml acqua distillata

25 ml di birra (non sgasata)

0,001 gr/litro di Cicloesimide

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA, acqua distillata e cicloesimide nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la di birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Test sui Batteri Lactobacillus e Pediococcus 

Terreno HLP

L'Hsu's Lactobacillus e Pediococcus è un terreno utilizzato favorire la presenza proprio di Lactobacillus e Pediococcus, nello specifico acido lattico Gram +.

7 gr di terreno HLP

2 gr di Agar

100 ml acqua distillata

Preparazione:  Aggiungere il terreno HLP, acqua distillata e ager nella beuta. Risulta importantissimo l'utilizzo di occhiali, schermo facciale e guanti, per proteggersi durante l'utilizzo dell'HLP. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione,  chiudendo prima la beuta con del cotone permeabile. Successivamente raffreddare il terreno fino a temperatura di 45 °C, versando poi 17 ml di terreno e 1 ml di campione, per ogni provetta. Utilizzare provette sterili con tappo avvitabile da 16X150 mm. Portate le provette a 30 °C per 48/60 ore, in un'incubatrice. Lactobacillus si presenteranno come colonie bianche a forma di lacrima capovolta mentre i Pediococcus di forma sferica con colonie bianche.

Test sui Batteri Lactobacillus

MRS Agar with Tween® 80

Terreno in polvere indicato per la coltivazione e l’isolamento dei lattobacilli. Il sodio acetato e l’ammonio citrato intensificano la crescita dei lattobacilli, mentre il magnesio solfato è inserito per motivi precauzionali poichè l’estratto di lievito dovrebbe fornire una quantità di magnesio sufficiente alla loro crescita.

70,2 g di MRS Agar o 55,2 g di MRS Broth 

1000 ml di acqua distillata fredda

Preparazione: Aggiungere il terreno e l'acqua fredda distillata nella beuta. Risulta importantissimo l'utilizzo di occhiali, schermo facciale e guanti, per proteggersi durante l'utilizzo dell'HLP. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (in autoclavare a 121°C per 15 minuti), chiudendo prima la beuta con del cotone permeabile. Successivamente raffreddare il terreno fino a temperatura di 45 °C, versando poi 10/15 ml di terreno e 1 ml di campione, per ogni provetta. Utilizzare provette sterili con tappo avvitabile da 16X150 mm. In funzione del tipo Lactobacillus e di ricerca da eseguire incubare tra i 35 °C e i 42°C per 48 ore, mentre per i soli lattobacilli psicrofili 25°C per 5 giorni. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Per il conteggio dei Lactobacillus Bulgaricus nello yogurt seminare 1 mL delle diluizioni decimali del campione in piastre sterili. Addizionare 15 ml di MRS Agar acidificato a pH 5,4 (consiglio l’uso di acido acetico), lasciare solidificare ed incubate a 37°C in anerobiosi per 72 ore. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Questo post è solo a scopo informativo, sulle mie esperienze, non mi assumo la responsabilità su ciò che farete e sui danni che potrete causare.

Il recupero del lievito da una cotta precedente, di Roberto Americano

Volevo segnalarvi questo video del mio caro amico Roberto Americano Perticarini, sul recupero del lievito da una cotta precedente.

A Caccia di Microrganismi Acidificanti

Con gli strumenti giusti è possibile catturare lieviti,

 in ogni parte, in ogni luogo.

Per dare la caccia a lieviti e batteri, le cortecce, le piante, i fiori e la frutta sono le migliori sorgenti di flora microbiologica. Dopo una prima esperienza con i lieviti (per saperne di più clicca qui) sono rimasto piacevolmente colpito dal successo ottenuto dal post, ancora oggi continua ad essere uno dei più letti e citati nel blog. Tuttavia ho iniziato una nuova e suggestiva ricerca, dove il mio interesse si è focalizzato principalmente sul legno. Sicuramente quello che si può ottenere dal legno lo si trova con più facilità nell'ambiente circostante ma i pori dei legni sono dei meravigliosi condomini, con la capacità di trasportare microrganismi anche nel tempo.

Gli ultimi mesi sono stati molto intensi, almeno dal punto di vista dell'impegno, diviso tra progetti e nuovi studi. Nonostante ciò, l'appagamento nel vivere queste intense emozioni è qualcosa di unico. Ma andiamo per ordine. Nei primi giorni di maggio il mio interesse è stato catturato dalla vista di vecchi accessori per la vinificazione. Qui in Calabria siamo pieni di storia e attrezzature sul vino, non manca occasione di trovare qualcosa di molto datato che non risponde più alle esigenze moderne. In quello stesso istante, un mio amico Vincenzo (presente anche sul gruppo Esperienze Casalingo Brassicole | HOMEBREWING CONDOR, per saperne di più clicca qui), mi ha incuriosito dicendomi: <<peccato che queste attrezzature non li possiamo usare per la birra.>>,  riferendosi in modo particolare alle botti. Proprio in quel preciso istante mi è salita l'incoscienza più totale. Se un problema non si risolve da solo, bisogna prenderlo di petto e affrontarlo. Se non esisteva modo di realizzare birre con quelle vecchie botti, potevamo trovare il modo di catturare i microrganismi presenti nei vecchi strumenti di legno. Dopo il pensiero iniziale, la consapevolezza ha fatto il resto, spostando la ricerca verso un livello più esteso. Volevo cercare la perfetta macchina del tempo, tra vecchi fienili, granai, mulini e cantine.

Una parte dell'impianto idraulico del Mulino

In breve tempo ho contattato diversi amici che potevano aiutarmi in questa ricerca. Il primo posto visionato, l'antico mulino ad acqua di Villapiana (CS), non ha dato i risultati sperati ma abbiamo volutamente preso un campione da una vecchia trave.

Quello che resta del Convento di San Francesco nell'Orto dei Monaci

Dopo una prima ricerca, non proprio esaltante, siamo passati a visionare il vecchio Convento di San Francesco, nell'Orto dei Monaci a Villapiana (CS). L'ipotesi suggestiva di entrare e vedere la cantina, chiusa da chissà quanto tempo, è rimasta solo un sogno. Successivamente grazie all'amico Davide Mastrangelo, con l'azienda agricola Versace di Corigliano Calabro, ho prelevato altri due campioni, provenienti rispettivamente dalla cantina e da un vecchio torchio vinario.

16 maggio / Primi segnali di vita

Nonostante i tanti altri posti visionati, mi restava ancora la possibilità di una antichissima cantina di mio zio, con enormi botti di rovere e molto altro ancora. La sola idea di trovare il genere Dekkera (introdotto da Van der Walt nel 1964, dopo l'osservazione al microscopio delle ascospore) mi esaltava a dismisura.

Progetto

Microrganismi Acidificanti

Se vi state chiedendo ancora cosa voglio trovare in un vecchio pezzo di legno, sappiate che l'obiettivo è quello di identificare e isolare i microrganismi acidificanti, differenziandoli tra lieviti e batteri. Tutto ciò in funzione di future birre sour. Detto ciò, questo progetto non è stato facile, il tempo dedicato è stato molto e impegnativo, senza trovare possibili scorciatoie. Grazie all'aiuto di alcuni amici ho potuto ottenere il materiale mancante al mio piccolo laboratorio (CondorLAB per saperne di più clicca qui) per la riuscita dell'intero progetto. 

Mini mosti 

Rifocillare i Microrganismi

La preparazione di questi mosti è fondamentale per l'intero progetto. Nel mio caso ho utilizzato del malto d'orzo ma si potrebbe provare anche con altri fermentabili. L'obiettivo è quello di ottenere un mosto con una densità tra 1.030 e 1.040 (per ogni litro di acqua servono, più o meno, 100 grammi di estratto). Sarebbe inoltre necessario quantificare il valore del pH del mosto, perchè potrebbe essere utile a fine fermentazione per la valutazione dei campioni.

Importante: fate particolare attenzione, tutto questo non è un gioco. Prelevare campioni con microrganismi in zone rurali, può portarvi a fermentazioni mortali, in presenza di  patogeni (clostridi, botulinum, listerie, salmonelle e ecc) e zuccheri fermentescibili. E' importante sapere che i patogeni mortali vivono in ambienti dove sono presenti animali da reddito.

Variazioni nei mosti: per cercare di minimizzare la presenza di patogeni, si potrebbe utilizzare del limone per tenere il mosto con un valore di pH  4.5. Un'altra possibile modifica potrebbe essere quella di aggiungere il luppolo, per la stessa ragione, ma non lo ritengo necessario. In ogni caso, se decidete di provare, in preparazione ricordatevi  di aggiungere al mosto una piccola quantità di luppolo in bollitura (per almeno 20 minuti). Anche se cosi facendo si esclude la presenza di batteri.

Dopo la preparazione e il successivo raffreddamento dei mosti, può essere versato e unito al campione, negli appositi contenitori di vetro (precedentemente sanitizzati).

Fermentazione

Non vedere segnali di attività fermentativa non è un problema, in tempi relativamente brevi. La fermentazione dovrebbe essere evidente dopo pochi giorni, con la presenza di piccole bolle in superficie (anidride carbonica). Nel caso contrario, con nessuna crescita e differenza di colore, lasciate i mosti per altre 48 ore. Nel giro di due settimane la fermentazione dovrebbe completarsi.

Nessuna Fermentazione

Se non si dovesse evidenziare nessuna fermentazione in superficie, dopo quattro giorni, vi consiglio di non perdere altro tempo e di buttare tutto.

Valutazione a fine fermentazione

Come prima cosa si può confrontare il ph iniziale, con quello finale. Nel caso di pH in diminuzione, in modo significativo, probabilmente  si tratta di una buona situazione. Mentre con un pH in aumento fareste meglio a scartare il mosto, anche per la vostra salute.

Test visivo: l'aspetto del mosto potrebbe darvi importanti informazioni. La sola presenza di muffe non significa che il mosto sia rovinato, mentre un mosto con una tonalità rossastra/arancio non dovrebbe essere assaggiato, anche per la vostra salute.

Test olfattivo: un odore gradevole (miele, agrumi, ecc.) sarebbe l'ideale. Mentre il mais in scatola è un aroma comune di certi lieviti selvaggi, che spesso non flocculano bene.

Test gustativo: prima di assaggiare, cercate di essere molto responsabili e rinunciate in caso di cattivi odori. Meglio buttare il campione e passare a quello successivo, senza rischiare nulla. Cosa diversa, in caso di sapori piacevoli, affrettatevi a prelevare il campione.

Crescita su Piastra

Terreni di coltura

Terreno

UBA Agar modificato

Risulta una buona base per una crescita generica. Nella preparazione del terreno, l'aggiunta di birra riduce la presenza microbica favorendo quelli che si sono adattati al luppolo ed alcol. Naturalmente l'utilizzo della birra è assolutamente facoltativo e non indispensabile. 

5,5 g di Terreno UBA
75 ml Acqua Distillata
25 ml di Birra (non sgasata)

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA e acqua distillata nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare la condensa, la parte del vetrino superiore deve essere lasciata aperta. In laboratorio si fanno asciugare sotto la cassa a flusso laminare, evitando contaminazioni, mentre tra le mura di casa il rischio è molto alto. Personalmente preferisco utilizzare la cappa dello sterilizzatore (quello della chicco) con il Bunsen, con il quale non ho riscontrato problemi di contaminazione, solo in due singole occasioni dove avevo commesso errori precedenti.

Diversamente se si vuole avere un approccio più casalingo verso la preparazione e gli stessi ingredienti, il libro Handbook of Microbiological Media di Ronald M. Atlas ci regala buone alternative molto economiche. Questo testo include differenti ricette che possono essere realizzate tranquillamente tra le mura di casa.

Terreno Alternativo

Potato Dextrose Agar

Perfetto per coltivare qualsiasi cosa.

Patate 300 gr

Glucosio o Saccarosio (zucchero da tavola) 20 gr

Agar 15 gr

Preparazione: tagliare le patate a dadini e metterle in 500 ml di acqua bollente, per 30 minuti. Tramite una garza il composto viene  filtrato, regolando il volume  su un litro con acqua distillata/deionizzata. Successivamente serve mescolare accuratamente aggiungendo l'agar al composto. Riscaldare il tutto a fuoco lento, portando ad ebollizione, aggiungendo 20 gr di glucosio e mescolando accuratamente. Passaggio in autoclave per 15 minuti a (15 psi di pressione) a 121 °C. Terminato questo passaggio, versare il Potato Dextrose Agarin nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Una volta scelti i campioni migliori, le probabilità di avere diversi ceppi di lievito, muffe e batteri, sono considerevoli. Dunque, per cercare di isolare i diversi microrganismi occorre utilizzare specifiche piastre di Petri e agar.

Crescita su Piastra

Terreni Selettivi

Questi particolari terreni favoriscono la crescita solo di specifici microrganismi, grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. Questi fattori vengono chiamati sostanze inibenti,  come ad esempio gli antibiotici. Detto questo, per isolare i diversi microrganismi presenti nei campioni iniziali, occorre avere o creare dei terreni selettivi. Un argomento sicuramente molto interessante con molteplici soluzioni, dettate principalmente dalle pratiche che più si adatta meglio alle proprie esigenze. Personalmente ho deciso di iniziare con queste differenti ricette di terreni selettivi, evitando l'acquisto di un terreno già bello e pronto.

Test sui Batteri

UBA Agar modificato con Cicloesimide

L'aggiunta di Cicloesimide, al terreno UBA Agar modificato, agevola l'eliminazione dei lieviti presenti nel campione, favorendo una migliore ricerca sulle contaminazioni batteriche. 

5,5 g di Terreno UBA

75 ml Acqua Distillata

25 ml di Birra (non sgasata)

0,001 gr/litro di Cicloesimide

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA, acqua distillata e cicloesimide nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Test sui Batteri Lactobacillus e Pediococcus 

Terreno HLP

L'Hsu's Lactobacillus e Pediococcus è un terreno utilizzato favorire la presenza proprio di Lactobacillus e Pediococcus, nello specifico acido lattico Gram +.

7 gr di Terreno HLP

2 gr di Agar

100 ml Acqua Distillata

Preparazione:  Aggiungere il terreno HLP, acqua distillata e ager nella beuta. Risulta importantissimo l'utilizzo di occhiali, schermo facciale e guanti, per proteggersi durante l'utilizzo dell'HLP. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione,  chiudendo prima la beuta con del cotone permeabile. Successivamente raffreddare il terreno fino a temperatura di 45 °C, versando poi 17 ml di terreno e 1 ml di campione, per ogni provetta. Utilizzare provette sterili con tappo avvitabile da 16X150 mm. Portate le provette a 30 °C per 48/60 ore, in un'incubatrice. Lactobacillus si presenteranno come colonie bianche a forma di lacrima capovolta metre i Pediococcus di forma sferica con colonie bianche.

Test sui Brettanomyces

Brettanomyces Agar

Crescita specifica di specie Brettanomyces.

5,0 gr di Destrosio

2,5 gr di Bacto-Peptone

1,5 gr di Estratto di Malto

1,5 gr di Estratto di Lievito

1,5 gr di base Azotata di Lievito (YNB)

0,5 gr di Cloramfenicolo

0,011 gr di Verde di Bromocresolo

0,01 gr di Tiamina

0,05 gr di Acido P-Cumarico

Cicloesimide a 0,01 gr / L

10 gr di Agar

Queste quantità sono per 500 ml

Questo terreno favorisce la crescita specifica delle specie Brettanomyces, dove la molecola dell''acido p-cumarico viene convertita in 4-etilfenolo dai Brettanomyces, producendo l'odore classico da Brett. Proprio per questo le colonie possono essere identificate dall'odore.

Terreno Alternativo

Potato Dextrose Agar 
Con aggiunte alternative

Patate 300 gr

Glucosio o Saccarosio (zucchero da tavola) 20 gr

Agar 15 gr

Aggiunte possibili
 a. Antibiotico
b. Antibiotico, Acido Lattico e Verde di Bromocresolo.
c. Antifungino, Succo di Mela e Saccarosio.

Preparazione: Tagliare le patate a dadini e metterle in 500 ml di acqua bollente, per 30 minuti. Tramite una garza il composto viene  filtrato, regolando il volume  su un litro con acqua distillata/deionizzata. Successivamente serve mescolare accuratamente aggiungendo l'agar al composto. Riscaldare il tutto a a fuoco lento, portando ad ebollizione, aggiungendo 20 gr di glucosio e mescolando accuratamente. Passaggio in autoclave per 15 minuti a (15 psi di pressione) a 121 °C. Terminato questo passaggio, versare il Potato Dextrose Agarin nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

a. Per isolare i lieviti bisogna aggiungere alla base di Potato Dextrose Agar un antibiotico, per inibire i batteri.

b. Per isolare i Brettanomyces può essere l'aggiunto al Potato Dextrose Agar un antibiotico (per inibire i batteri) e acido lattico o succo di limone, per abbassare il pH a 3 e inibire gli altri lieviti. Mentre per favorire la differenziazione dei Brettanomyces serve del Verde di bromocresolo.

c. Per isolare dei batteri l'ideale sarebbe utilizzare un antimicotico o antifungino. Per i Lactobacillus si potrebbe aggiungere una parte di succo di mela e saccarosio (zucchero da tavola) al posto del glucosio per consentire la differenziazione. I Lactobacillus crescono come piccole colonie mentre il saccarosio gli consente di formare grandi colonie.

Strisciare una Piastra

Strisciare una piastra non risulta una cosa difficile, utilizzando un'ansa da inoculo (precedentemente sterilizzata) bisogna solamente immergerla in una fonte di campione e passarla successivamente sulla superficie di agar (per saperne di più clicca qui).

Prelevare e Trasferire le Colonie da una Piastra
Individuare e prelevare le colonie, da una piastra, non risulta una cosa difficile. L'intero processo inizia con la verifica della crescita, nella prima area strisciata si dovrebbe notare una crescita maggiore, con una coltura di lievito densa, mentre la crescita continua scemando verso la parte finale dello striscio (per saperne di più clicca qui).

Oltre all'utilizzo del libro "Handbook of Microbiological Media" di Ronald M. Atlas, ho consultato per le ricette dei terreni anche il libro "Il lievito" di  Chris White, Jamil Zainasheff.

Osservazione al Microscopio

Osservazione tramite microscopio della morfologia dei lieviti, 

con la replicazione per gemmazione.

Foto in alto, nel colore giallo è chiaramente visibile la singola cellula di Saccharomyces, dal nucleo alle membrane, cellulare e nucleare. Nel colore verde si vede l'inizio della fase di divisione, dove i cromosomi sono attaccati a una struttura chiamata corpo polare del fuso, che si duplica dando inizio alla divisione. Mentre nel cerchio rosso si sta per concludere la divisione cellulare. I cromosomi sono già separati, arrivati nella gemma, per formare il corredo genetico della nuova cellula figlia (per saperne di più clicca qui).

Le cellule de Brettanomyces sono di dimensione media (2.0-5.5 per 3.0-22.0) e si presentano  sferoidali, ellissoidali, spesso ogivali o cilindroidi per allungarsi. Le cellule assumono molte forme, tra cui singole, coppie, catene corte e cluster. Generalmente formano un Pseudomicelio ramificate e si può formare un micelio non settato a cellule singole. La separazione incompleta porta ad alcune catene. Generalmente il nome Dekkera viene usato intercambiabilmente con Brettanomyces, dato che descrive la telemorfosi o forma delle spore del lievito. La morfologia delle spore è da uno a quattro, a forma sferoidale, con ascospore tangenti.

Brettanomyces: forma asessuale, non sporigena

Dekkera: forma sessuale, sporigena.

Il genere Brettanomyces/Dekkera include cinque specie:
Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus; Brettanomyces naardenensis e Brettanomyces nanus. Nelle prime due specie sono state osservate le forme sporigene che prendono rispettivamente il nome di Dekkera bruxellensis e Dekkera anomalus.

Conclusione

Ogni risultato è la consapevolezza della propria passione

Dalle varie osservazioni su piastra il Brettanomyces che ho isolato e conservato risulta molto simile al Brettanomyces Bruxellensis).

Questa ricerca mi ha dato la possibilità di verificare e conservare dei microrganismi custoditi nel tempo da un semplice pezzo di legno. Nello specifico un vecchio pezzo di legno di un torchio da vino, proveniente all'azienda agricola Versace di Corigliano Calabro per gradita concessione dell'amico Davide Mastrangelo. L'emozione è stata molta, avere un proprio Brettanomyces a disposizione non è una cosa del tutto comune. Naturalmente come potete notare anche dalle immagini al microscopio i Brettanomyces non sono risultati gli unici microrganismi presenti nel campione iniziale. Ho trovato diverse specie batteriche e diversi Saccharomyces (selvaggi e addomesticati). Nonostante ciò ho ritenuto di conservare solo i Brettanomyces/Dekkera, aspettando di utilizzarli nelle future fermentazioni Sour.

Conservazione

Brettanomyces/Dekkera

Seguendo adeguate accortezze ho conservato

 dei campioni in congelatore.

Le condizioni igieniche perfette sono fondamentali per questo tipo di processo conservativo. E' importante essere coscienti di cosa si stia facendo, perchè una cattiva gestione potrebbe aumentare il rischio d'infezione, con le dovute conseguenze del caso (per saperne di più clicca qui).

Questa post è solo a scopo informativo, sulle mie esperienze, non mi assumo la responsabilità su ciò che farete e sui danni che potrete causare.