venerdì 25 gennaio 2019

Terreni di Coltura

Generalmente per terreni di coltura si intende una soluzione solida o liquida, contenente sostanze nutritive per la crescita e la ricerca microbica. 

Crescita su Piastra
UBA Agar modificato
Risulta una buona base per una crescita generica. Nella preparazione del terreno, l'aggiunta di birra riduce la presenza microbica favorendo quelli che si sono adattati al luppolo ed alcol. Naturalmente l'utilizzo della birra è assolutamente facoltativo e non indispensabile. 

5,5 g di terreno UBA
75 ml acqua distillata
25 ml di birra (non sgasata)

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA e acqua distillata nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la di birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare la condensa, la parte del vetrino superiore deve essere lasciata aperta. In laboratorio si fanno asciugare sotto la cassa a flusso laminare, evitando contaminazioni, mentre tra le mura di casa il rischio è molto alto. Personalmente preferisco utilizzare la cappa dello sterilizzatore (quello della chicco) con il Bunsen, con il quale non ho riscontrato problemi di contaminazione, solo in due singole occasioni dove avevo commesso errori precedenti.

Terreno Alternativo
Sabouraud Agar
Questo terreno risulta un'ottima alternativa all' UBA Agar modificato, per una crescita microbica generica.

20 gr di Destrosio
10 g di Agar
5 g di Bacto Peptone
pH di 5,6
Acqua distillata
Queste quantità sono per 500 ml

Diversamente se si vuole avere un approccio più casalingo verso la preparazione e gli stessi ingredienti, il libro Handbook of Microbiological Media di Ronald M. Atlas ci regala buone alternative molto economiche. Questo testo include differenti ricette che possono essere realizzate tranquillamente tra le mura di casa.

Terreno Alternativo
Potato Dextrose Agar
perfetto per coltivare qualsiasi cosa

Patate 300 gr
Glucosio o Saccarosio (zucchero da tavola) 20 gr
Agar 15 gr

Preparazione: tagliare le patate a dadini e metterle in 500 ml di acqua bollente, per 30 minuti. Tramite una garza il composto viene  filtrato, regolando il volume  su un litro con acqua distillata/deionizzata. Successivamente serve mescolare accuratamente aggiungendo l'agar al composto. Riscaldare il tutto a fuoco lento, portando ad ebollizione, aggiungendo 20 gr di glucosio e mescolando accuratamente. Passaggio in autoclave per 15 minuti a (15 psi di pressione) a 121 °C. Terminato questo passaggio, versare il Potato Dextrose Agarin nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.


Una volta scelti i campioni migliori, le probabilità di avere diversi ceppi di lievito, muffe e batteri, sono considerevoli. Dunque, per cercare di isolare i diversi microrganismi occorre utilizzare specifiche piastre di Petri e agar.

Crescita su Piastra
Terreni Selettivi
Questi particolari terreni favoriscono la crescita solo di specifici microrganismi, grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. Questi fattori vengono chiamati sostanze inibenti,  come ad esempio gli antibiotici. Detto questo, per isolare i diversi microrganismi presenti nei campioni iniziali, occorre avere o creare dei terreni selettivi. Un argomento sicuramente molto interessante con molteplici soluzioni, dettate principalmente dalle pratiche che più si adatta meglio alle proprie esigenze. Personalmente ho deciso di iniziare con queste differenti ricette di terreni selettivi, evitando l'acquisto di un terreno già bello e pronto.


Test sui Lieviti
Sabouraud Agar con Cloramfenicolo
Questo terreno risulta ottimo per una crescita dei lieviti.

Partendo dal terreno Sabouraud Agar ho aggiunto 0,25 gr di Cloramfenicolo, un forte antibiotico antimicrobico progettato per uccidere i batteri Gram + e Gram −.


MYPG + CuSO4 medium
utile a differenziare i Saccharomyces dai ceppi selvatici di Saccharomyces
1,5 gr di estratto di malto
1,5 gr di estratto di lievito
5,0 gr di glucosio
2,5 gr di Bacto Peptone
0,156 gr di CuSO4 - 5 H2O
pH di 6,2
Queste quantità sono per 500 ml

Il terzo media differenziale che ho usato era il media CuSO4 MYPG. Solfato di rame viene generalmente utilizzato per differenziare tra Saccharomyces e ceppi selvatici di Saccharomyces , non Brettanomyces. Anche se, Chad Yakobson di Crooked Stave ha avuto un po 'di fortuna con la crescita di Brett su lastre di CuSO4.


Test sui Brettanomyces
Brettanomyces Agar
fa crescere specificatamente le specie Brettanomyces
5,0 gr di destrosio
2,5 gr di Bacto-peptone
1,5 gr di estratto di malto
1,5 gr di estratto di lievito
1,5 gr di base azotata di lievito (YNB)
0,5 gr di cloramfenicolo
0,011 gr di verde di bromocresolo
0,01 gr di tiamina
0,05 gr di acido p-cumarico
Cicloesimide a 0,01 gr / L
10 g di Agar
Queste quantità sono per 500 ml

Infine ho realizzato Brettanomyces Agar . Ho trovato questa ricetta nel manuale dei lieviti alimentari . Questa formulazione fa crescere specificatamente le specie Brettanomyces . È interessante notare che ho aggiunto l'acido p-cumarico (per gentile concessione della Brooklyn Brewery). Questa molecola viene convertita in 4-etilfenolo da Brettanomyces e produce il classico odore di Brett: coperta di cavallo, aia e mousy. Le colonie possono essere identificate dall'odore.


Test sui Batteri
UBA Agar modificato con Cicloesimide
L'aggiunta di con Cicloesimide, al terreno UBA Agar modificato, agevola l'eliminazione dei lieviti presenti nel campione, favorendo una migliore ricerca sulle contaminazioni batteriche. 


5,5 g di terreno UBA
75 ml acqua distillata
25 ml di birra (non sgasata)
0,001 gr/litro di Cicloesimide

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA, acqua distillata e cicloesimide nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la di birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.


Test sui Batteri Lactobacillus e Pediococcus 
Terreno HLP
L'Hsu's Lactobacillus e Pediococcus è un terreno utilizzato favorire la presenza proprio di Lactobacillus e Pediococcus, nello specifico acido lattico Gram +.


7 gr di terreno HLP
2 gr di Agar
100 ml acqua distillata

Preparazione:  Aggiungere il terreno HLP, acqua distillata e ager nella beuta. Risulta importantissimo l'utilizzo di occhiali, schermo facciale e guanti, per proteggersi durante l'utilizzo dell'HLP. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione,  chiudendo prima la beuta con del cotone permeabile. Successivamente raffreddare il terreno fino a temperatura di 45 °C, versando poi 17 ml di terreno e 1 ml di campione, per ogni provetta. Utilizzare provette sterili con tappo avvitabile da 16X150 mm. Portate le provette a 30 °C per 48/60 ore, in un'incubatrice. Lactobacillus si presenteranno come colonie bianche a forma di lacrima capovolta mentre i Pediococcus di forma sferica con colonie bianche.


Questa post è solo a scopo informativo, sulle mie esperienze, non mi assumo la responsabilità su ciò che farete e sui danni che potrete causare.

Il recupero del lievito da una cotta precedente, di Roberto Americano

Volevo segnalarvi questo video del mio caro amico Roberto Americano Perticarini, sul recupero del lievito da una cotta precedente.


Scusate per la lunga assenza!

Ciao amici Casalingo Brassicoli, eccomi di nuovo qui a scrivere sul mio blog.

Per farla breve mi siete mancati!


Lavoro e famiglia mi hanno portato via un sacco di tempo e se in mezzo a tutto questo ci mettiamo anche il calcio, ecco giustificata la mia assenza dal blog e dal gruppo facebook. Certo, avete pienamente ragione, per giocare a calcio non ho più l’età, inoltre il campionato di promozione non è del tutto rilassante per un produttore di birra. Una pessima scelta per le mie esperienze casalingo brassicole, in queste settimane sono rimasto letteralmente a secco, senza un goccio di birra.

Che pessima fine per un casalingo brassicolo!

Pertanto non mi resta che attendere tempi migliori, ritagliandomi il giusto spazio e tempo, da dedicare esclusivamente alla birra. Ho deciso di organizzarmi meglio per alleviare questa mia grossa mancanza, iniziando dai vecchi progetti che sembravano ormai accantonati.

Ultima cosa, occhio, il Condor è tornato!

Ciao a tutti, belli, brutti e farabutti!!!

lunedì 24 dicembre 2018

Auguri di Buon Natale a tutti voi!

E' tempo di festa, di regali inattesi, di poesie sincere e di frasi preconfezionate, di sguardi felici, di addobbi scintillanti, è un tempo... speciale, che diventa decisamente straordinario se condiviso con le persone che si amano.

Vi auguro il Natale più bello...

sabato 17 novembre 2018

Per gli amici del fai da te: Maltazione

.Fai da te.
La trasformazione dell'orzo in malto è importante 
almeno quanto la birrificazione stessa.

Essiccazione al sole
Dopo essere passato alla birrificazione con il metodo All-Grain, mi incuriosiva molto la possibilità di maltare l'orzo in casa. Dopo diversi tentativi e discreti risultati, ho deciso di non occuparmi più della maltazione casalinga. Stranamente, dopo diversi anni mi ritrovo a scrivere proprio un post sulla Maltazione. Questo cambiamento è stato dovuto allo studio e alla pratica  delle birre Norvegesi, Norwegian Farmhouse Ale (per saperne di più clicca qui), dove l'utilizzo del proprio malto è una componente molto comune.

ORZO
Hordeum Vulgare
L'orzo è il principale cereale per la produzione della birra. Ottenuto dalle cariossidi dell'Hordeum vulgare (Graminacee), si tratta di una delle piante più anticamente coltivate, dal Neolitico. Nel nostro caso è indispensabile sapere le due differenti varietà, esastico e districo, i quali si riferiscono al numero di semi sulla spiga.

Esastico
In questa varietà i grani si presentono con file tutte intorno alla spiga. La maltazione di questo tipo di orzo produce meno estratto ma contiene molti enzimi, utili per favorire la conversione degli amidi in zuccheri. Quest'ultimo aspetto rende questa varietà utile, nella produzione di birre, dove vengono impiegati molti cereali non maltati.

Distico
In questa varietà i grani si presentono in una singola fila e su entrambi i lati della spiga, con una forma fortemente appiattita (definita “two-row”). Questa varietà risulta con un maggiore rendimento, con chicchi più grandi e un contenuto di azoto, proteine inferiori e glume più piccole. Risulta l'orzo preferito per la brassazione, in quanto più idoneo per caratteristiche e con una certa regolarità in maltazione.

Maltazione
La trasformazione dell'orzo in malto è importante
almeno quanto la birrificazione stessa.

La maltazione è molto impegnativa e richiede molta attenzione se si vuole ottenere un ottimo prodotto finito. Difficilmente questo processo viene realizzato tra le mura di casa. Troppo spesso è considerato al di fuori della portata di noi semplici Casalingo Brassicoli, mentre con una consapevolezza maggiore si possono favorire nuovi scenari, nella produzione delle proprie birre.

Tra i vari passaggi che consentono questa trasformazione ci sono:
a. Pregerminazione.
b. Germinazione.
c. Essiccamento

Pregerminazione
Pulizia con Bagnatura
Prima di procedere con i vari passaggi bisogna pesare i grani in modo da valutare in seguito se lo stesso sia realmente asciutto, dunque privo di acqua. Ottenuto il risultato del peso, conservate il valore o semplicemente ricordatelo. Fatto questo è possibile passare alla pulizia dei grani, rimuovendo eventuali rifiuti residui della raccolta. Questo passaggio risulta abbastanza facile in acqua, perchè questi stessi rifiuti restano in superficie diversamente dai grani. E' sufficiente versare dell'acqua in un recipiente con al suo interno i grani, mescolare e aspettare che i grani vadano a depositarsi nuovamente sul fondo, eliminando i rifiuti in superficie possibilmente con un cucchiaio con setaccio.

Metodo Aerato
Germinazione 
Bagnatura dei Grani
In realtà esistono due principali metodi per questo processo di germinazione, aerato e non aerato. In quello non aerato vi basterà lasciare i grani in acqua per una piena idratazione. Mentre con il metodo aerato bisogna lasciare i grani in acqua tra le 12 e le 24 ore, in un contenitore, utilizzando un meccanismo di ricircolo dell'acqua o una più semplice pompa da acquario con relativa pietra porosa. Personalmente faccio questo passaggio tramite una  bagnarole grande collegata ad un motore filtro da piscina. Il tutto deve essere realizzato con acqua a temperatura bassa, possibilmente non superiori ai 10 °C. Per evitare ulteriori passaggi durante il cambio dell'acqua, immergo i grani in un sacco grosso da cereali evitando di riempirlo, in modo da lasciare un discreto spazio al suo interno. Per una piena idratazione i grani a fine bagnatura dovranno avere un peso del 50% in più ed un'espansione di circa il 150%, rispetto al volume iniziale.


Germinazione
Subito dopo la piena idratazione bisogna filtrare al meglio i grani e lasciarli al buio, a circa 10 °C. La temperatura dovuta al processo di germinazione non deve superare i 20 °C, preferendo un range tra i 15 e i 18 °C. Per evitare che i grani si possano seccare troppo e soffocare per la troppa anidride carbonica (aumentando cosi anche la temperatura) è indispensabile girarli frequentemente. A circa tre giorni di germinazione le radichette inizieranno la crescita (germoglio o acrospira). Con una crescita del germoglio fino a tre quarti della lunghezza del chicco, i grani possono essere passati all'essiccazione.

Essiccazione
Il malto può essere considerato asciutto quando torna al peso originario. Questo processo deve essere fatto ad una temperatura iniziale non superiore ai 38 °C, differentemente dal metodo di utilizzo. Durante questo processo possiamo alzare la temperatura per ottenere un malto base Pale (tra i 49/66 °C). I tempi dell'intero processo essiccativo possono variare dalle 12 alle 24 ore. A processo finito le radichette secche vanno eliminate tramite sfregamento o setaccio.

Tostatura
L'eventuale tostatura deve avvenire in tempi e temperatura differenti, per ottenere i malti speciali desiderati. Nel cercare di creare malto che sia abbastanza uniforme, utilizzando una teglia da forno, non andate oltre i 2 cm di spessore. Tipo: malto Munich a 105 °C per circa 4 ore; Vienna tra 102/107 °C per circa 3 ore e Biscuit a 178 °C per 10/15 minuti.

Questa post è solo a scopo informativo, sulle mie esperienze, non mi assumo la responsabilità su ciò che farete e sui danni che potrete causare.

martedì 13 novembre 2018

A Caccia di Microrganismi Acidificanti


Con gli strumenti giusti è possibile catturare lieviti,
 in ogni parte, in ogni luogo.

Per dare la caccia a lieviti e batteri, le cortecce, le piante, i fiori e la frutta sono le migliori sorgenti di flora microbiologica. Dopo una prima esperienza con i lieviti (per saperne di più clicca qui) sono rimasto piacevolmente colpito dal successo ottenuto dal post, ancora oggi continua ad essere uno dei più letti e citati nel blog. Tuttavia ho iniziato una nuova e suggestiva ricerca, dove il mio interesse si è focalizzato principalmente sul legno. Sicuramente quello che si può ottenere dal legno lo si trova con più facilità nell'ambiente circostante ma i pori dei legni sono dei meravigliosi condomini, con la capacità di trasportare microrganismi anche nel tempo.

Gli ultimi mesi sono stati molto intensi, almeno dal punto di vista dell'impegno, diviso tra progetti e nuovi studi. Nonostante ciò, l'appagamento nel vivere queste intense emozioni è qualcosa di unico. Ma andiamo per ordine. Nei primi giorni di maggio il mio interesse è stato catturato dalla vista di vecchi accessori per la vinificazione. Qui in Calabria siamo pieni di storia e attrezzature sul vino, non manca occasione di trovare qualcosa di molto datato che non risponde più alle esigenze moderne. In quello stesso istante, un mio amico Vincenzo (presente anche sul gruppo Esperienze Casalingo Brassicole | HOMEBREWING CONDOR, per saperne di più clicca qui), mi ha incuriosito dicendomi: <<peccato che queste attrezzature non li possiamo usare per la birra.>>,  riferendosi in modo particolare alle botti. Proprio in quel preciso istante mi è salita l'incoscienza più totale. Se un problema non si risolve da solo, bisogna prenderlo di petto e affrontarlo. Se non esisteva modo di realizzare birre con quelle vecchie botti, potevamo trovare il modo di catturare i microrganismi presenti nei vecchi strumenti di legno. Dopo il pensiero iniziale, la consapevolezza ha fatto il resto, spostando la ricerca verso un livello più esteso. Volevo cercare la perfetta macchina del tempo, tra vecchi fienili, granai, mulini e cantine.

Una parte dell'impianto idraulico del Mulino
In breve tempo ho contattato diversi amici che potevano aiutarmi in questa ricerca. Il primo posto visionato, l'antico mulino ad acqua di Villapiana (CS), non ha dato i risultati sperati ma abbiamo volutamente preso un campione da una vecchia trave.

Quello che resta del Convento di San Francesco nell'Orto dei Monaci
Dopo una prima ricerca, non proprio esaltante, siamo passati a visionare il vecchio Convento di San Francesco, nell'Orto dei Monaci a Villapiana (CS). L'ipotesi suggestiva di entrare e vedere la cantina, chiusa da chissà quanto tempo, è rimasta solo un sogno. Successivamente grazie all'amico Davide Mastrangelo, con l'azienda agricola Versace di Corigliano Calabro, ho prelevato altri due campioni, provenienti rispettivamente dalla cantina e da un vecchio torchio vinario.

16 maggio / Primi segnali di vita
Nonostante i tanti altri posti visionati, mi restava ancora la possibilità di una antichissima cantina di mio zio, con enormi botti di rovere e molto altro ancora. La sola idea di trovare il genere Dekkera (introdotto da Van der Walt nel 1964, dopo l'osservazione al microscopio delle ascospore) mi esaltava a dismisura.

Progetto
Microrganismi Acidificanti

Se vi state chiedendo ancora cosa voglio trovare in un vecchio pezzo di legno, sappiate che l'obiettivo è quello di identificare e isolare i microrganismi acidificanti, differenziandoli tra lieviti e batteri. Tutto ciò in funzione di future birre sour. Detto ciò, questo progetto non è stato facile, il tempo dedicato è stato molto e impegnativo, senza trovare possibili scorciatoie. Grazie all'aiuto di alcuni amici ho potuto ottenere il materiale mancante al mio piccolo laboratorio (CondorLAB per saperne di più clicca qui) per la riuscita dell'intero progetto. 

Mini mosti 
Rifocillare i Microrganismi


La preparazione di questi mosti è fondamentale per l'intero progetto. Nel mio caso ho utilizzato del malto d'orzo ma si potrebbe provare anche con altri fermentabili. L'obiettivo è quello di ottenere un mosto con una densità tra 1.030 e 1.040 (per ogni litro di acqua servono, più o meno, 100 grammi di estratto). Sarebbe inoltre necessario quantificare il valore del pH del mosto, perchè potrebbe essere utile a fine fermentazione per la valutazione dei campioni.

Importante: fate particolare attenzione, tutto questo non è un gioco. Prelevare campioni con microrganismi in zone rurali, può portarvi a fermentazioni mortali, in presenza di  patogeni (clostridi, botulinum, listerie, salmonelle e ecc) e zuccheri fermentescibili. E' importante sapere che i patogeni mortali vivono in ambienti dove sono presenti animali da reddito.

Variazioni nei mosti: per cercare di minimizzare la presenza di patogeni, si potrebbe utilizzare del limone per tenere il mosto con un valore di pH  4.5. Un'altra possibile modifica potrebbe essere quella di aggiungere il luppolo, per la stessa ragione, ma non lo ritengo necessario. In ogni caso, se decidete di provare, in preparazione ricordatevi  di aggiungere al mosto una piccola quantità di luppolo in bollitura (per almeno 20 minuti). Anche se cosi facendo si esclude la presenza di batteri.

Dopo la preparazione e il successivo raffreddamento dei mosti, può essere versato e unito al campione, negli appositi contenitori di vetro (precedentemente sanitizzati).

Fermentazione
Non vedere segnali di attività fermentativa non è un problema, in tempi relativamente brevi. La fermentazione dovrebbe essere evidente dopo pochi giorni, con la presenza di piccole bolle in superficie (anidride carbonica). Nel caso contrario, con nessuna crescita e differenza di colore, lasciate i mosti per altre 48 ore. Nel giro di due settimane la fermentazione dovrebbe completarsi.

Nessuna Fermentazione
Se non si dovesse evidenziare nessuna fermentazione in superficie, dopo quattro giorni, vi consiglio di non perdere altro tempo e di buttare tutto.

Valutazione a fine fermentazione
Come prima cosa si può confrontare il ph iniziale, con quello finale. Nel caso di pH in diminuzione, in modo significativo, probabilmente  si tratta di una buona situazione. Mentre con un pH in aumento fareste meglio a scartare il mosto, anche per la vostra salute.

Test visivo: l'aspetto del mosto potrebbe darvi importanti informazioni. La sola presenza di muffe non significa che il mosto sia rovinato, mentre un mosto con una tonalità rossastra/arancio non dovrebbe essere assaggiato, anche per la vostra salute.

Test olfattivo: un odore gradevole (miele, agrumi, ecc.) sarebbe l'ideale. Mentre il mais in scatola è un aroma comune di certi lieviti selvaggi, che spesso non flocculano bene.

Test gustativo: prima di assaggiare, cercate di essere molto responsabili e rinunciate in caso di cattivi odori. Meglio buttare il campione e passare a quello successivo, senza rischiare nulla. Cosa diversa, in caso di sapori piacevoli, affrettatevi a prelevare il campione.

Crescita su Piastra
Terreni di coltura
Terreno
UBA Agar modificato
Risulta una buona base per una crescita generica. Nella preparazione del terreno, l'aggiunta di birra riduce la presenza microbica favorendo quelli che si sono adattati al luppolo ed alcol. Naturalmente l'utilizzo della birra è assolutamente facoltativo e non indispensabile. 

5,5 g di Terreno UBA
75 ml Acqua Distillata
25 ml di Birra (non sgasata)


Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA e acqua distillata nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare la condensa, la parte del vetrino superiore deve essere lasciata aperta. In laboratorio si fanno asciugare sotto la cassa a flusso laminare, evitando contaminazioni, mentre tra le mura di casa il rischio è molto alto. Personalmente preferisco utilizzare la cappa dello sterilizzatore (quello della chicco) con il Bunsen, con il quale non ho riscontrato problemi di contaminazione, solo in due singole occasioni dove avevo commesso errori precedenti.

Diversamente se si vuole avere un approccio più casalingo verso la preparazione e gli stessi ingredienti, il libro Handbook of Microbiological Media di Ronald M. Atlas ci regala buone alternative molto economiche. Questo testo include differenti ricette che possono essere realizzate tranquillamente tra le mura di casa.

Terreno Alternativo
Potato Dextrose Agar
Perfetto per coltivare qualsiasi cosa.

Patate 300 gr
Glucosio o Saccarosio (zucchero da tavola) 20 gr
Agar 15 gr

Preparazione: tagliare le patate a dadini e metterle in 500 ml di acqua bollente, per 30 minuti. Tramite una garza il composto viene  filtrato, regolando il volume  su un litro con acqua distillata/deionizzata. Successivamente serve mescolare accuratamente aggiungendo l'agar al composto. Riscaldare il tutto a fuoco lento, portando ad ebollizione, aggiungendo 20 gr di glucosio e mescolando accuratamente. Passaggio in autoclave per 15 minuti a (15 psi di pressione) a 121 °C. Terminato questo passaggio, versare il Potato Dextrose Agarin nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.


Una volta scelti i campioni migliori, le probabilità di avere diversi ceppi di lievito, muffe e batteri, sono considerevoli. Dunque, per cercare di isolare i diversi microrganismi occorre utilizzare specifiche piastre di Petri e agar.

Crescita su Piastra
Terreni Selettivi
Questi particolari terreni favoriscono la crescita solo di specifici microrganismi, grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. Questi fattori vengono chiamati sostanze inibenti,  come ad esempio gli antibiotici. Detto questo, per isolare i diversi microrganismi presenti nei campioni iniziali, occorre avere o creare dei terreni selettivi. Un argomento sicuramente molto interessante con molteplici soluzioni, dettate principalmente dalle pratiche che più si adatta meglio alle proprie esigenze. Personalmente ho deciso di iniziare con queste differenti ricette di terreni selettivi, evitando l'acquisto di un terreno già bello e pronto.

Test sui Batteri
UBA Agar modificato con Cicloesimide
L'aggiunta di Cicloesimide, al terreno UBA Agar modificato, agevola l'eliminazione dei lieviti presenti nel campione, favorendo una migliore ricerca sulle contaminazioni batteriche. 

5,5 g di Terreno UBA
75 ml Acqua Distillata
25 ml di Birra (non sgasata)
0,001 gr/litro di Cicloesimide

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA, acqua distillata e cicloesimide nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.


Test sui Batteri Lactobacillus e Pediococcus 
Terreno HLP
L'Hsu's Lactobacillus e Pediococcus è un terreno utilizzato favorire la presenza proprio di Lactobacillus e Pediococcus, nello specifico acido lattico Gram +.

7 gr di Terreno HLP
2 gr di Agar
100 ml Acqua Distillata

Preparazione:  Aggiungere il terreno HLP, acqua distillata e ager nella beuta. Risulta importantissimo l'utilizzo di occhiali, schermo facciale e guanti, per proteggersi durante l'utilizzo dell'HLP. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione,  chiudendo prima la beuta con del cotone permeabile. Successivamente raffreddare il terreno fino a temperatura di 45 °C, versando poi 17 ml di terreno e 1 ml di campione, per ogni provetta. Utilizzare provette sterili con tappo avvitabile da 16X150 mm. Portate le provette a 30 °C per 48/60 ore, in un'incubatrice. Lactobacillus si presenteranno come colonie bianche a forma di lacrima capovolta metre i Pediococcus di forma sferica con colonie bianche.


Test sui Brettanomyces
Brettanomyces Agar
Crescita specifica di specie Brettanomyces.

5,0 gr di Destrosio
2,5 gr di Bacto-Peptone
1,5 gr di Estratto di Malto
1,5 gr di Estratto di Lievito
1,5 gr di base Azotata di Lievito (YNB)
0,5 gr di Cloramfenicolo
0,011 gr di Verde di Bromocresolo
0,01 gr di Tiamina
0,05 gr di Acido P-Cumarico
Cicloesimide a 0,01 gr / L
10 gr di Agar
Queste quantità sono per 500 ml

Questo terreno favorisce la crescita specifica delle specie Brettanomyces, dove la molecola dell''acido p-cumarico viene convertita in 4-etilfenolo dai Brettanomyces, producendo l'odore classico da Brett. Proprio per questo le colonie possono essere identificate dall'odore.


Terreno Alternativo
Potato Dextrose Agar 
Con aggiunte alternative

Patate 300 gr
Glucosio o Saccarosio (zucchero da tavola) 20 gr
Agar 15 gr

Aggiunte possibili
 a. Antibiotico
b. Antibiotico, Acido Lattico e Verde di Bromocresolo.
c. Antifungino, Succo di Mela e Saccarosio.

Preparazione: Tagliare le patate a dadini e metterle in 500 ml di acqua bollente, per 30 minuti. Tramite una garza il composto viene  filtrato, regolando il volume  su un litro con acqua distillata/deionizzata. Successivamente serve mescolare accuratamente aggiungendo l'agar al composto. Riscaldare il tutto a a fuoco lento, portando ad ebollizione, aggiungendo 20 gr di glucosio e mescolando accuratamente. Passaggio in autoclave per 15 minuti a (15 psi di pressione) a 121 °C. Terminato questo passaggio, versare il Potato Dextrose Agarin nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

a. Per isolare i lieviti bisogna aggiungere alla base di Potato Dextrose Agar un antibiotico, per inibire i batteri.

b. Per isolare i Brettanomyces può essere l'aggiunto al Potato Dextrose Agar un antibiotico (per inibire i batteri) e acido lattico o succo di limone, per abbassare il pH a 3 e inibire gli altri lieviti. Mentre per favorire la differenziazione dei Brettanomyces serve del Verde di bromocresolo.

c. Per isolare dei batteri l'ideale sarebbe utilizzare un antimicotico o antifungino. Per i Lactobacillus si potrebbe aggiungere una parte di succo di mela e saccarosio (zucchero da tavola) al posto del glucosio per consentire la differenziazione. I Lactobacillus crescono come piccole colonie mentre il saccarosio gli consente di formare grandi colonie.

Strisciare una Piastra
Strisciare una piastra non risulta una cosa difficile, utilizzando un'ansa da inoculo (precedentemente sterilizzata) bisogna solamente immergerla in una fonte di campione e passarla successivamente sulla superficie di agar (per saperne di più clicca qui).

Prelevare e Trasferire le Colonie da una Piastra
Individuare e prelevare le colonie, da una piastra, non risulta una cosa difficile. L'intero processo inizia con la verifica della crescita, nella prima area strisciata si dovrebbe notare una crescita maggiore, con una coltura di lievito densa, mentre la crescita continua scemando verso la parte finale dello striscio (per saperne di più clicca qui).

Oltre all'utilizzo del libro "Handbook of Microbiological Media" di Ronald M. Atlas, ho consultato per le ricette dei terreni anche il libro "Il lievito" di  Chris White, Jamil Zainasheff.

Osservazione al Microscopio

Osservazione tramite microscopio della morfologia dei lieviti, 
con la replicazione per gemmazione.

Foto in alto, nel colore giallo è chiaramente visibile la singola cellula di Saccharomyces, dal nucleo alle membrane, cellulare e nucleare. Nel colore verde si vede l'inizio della fase di divisione, dove i cromosomi sono attaccati a una struttura chiamata corpo polare del fuso, che si duplica dando inizio alla divisione. Mentre nel cerchio rosso si sta per concludere la divisione cellulare. I cromosomi sono già separati, arrivati nella gemma, per formare il corredo genetico della nuova cellula figlia (per saperne di più clicca qui).





Le cellule de Brettanomyces sono di dimensione media (2.0-5.5 per 3.0-22.0) e si presentano  sferoidali, ellissoidali, spesso ogivali o cilindroidi per allungarsi. Le cellule assumono molte forme, tra cui singole, coppie, catene corte e cluster. Generalmente formano un Pseudomicelio ramificate e si può formare un micelio non settato a cellule singole. La separazione incompleta porta ad alcune catene. Generalmente il nome Dekkera viene usato intercambiabilmente con Brettanomyces, dato che descrive la telemorfosi o forma delle spore del lievito. La morfologia delle spore è da uno a quattro, a forma sferoidale, con ascospore tangenti.

Brettanomyces: forma asessuale, non sporigena
Dekkera: forma sessuale, sporigena.

Il genere Brettanomyces/Dekkera include cinque specie:
Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus; Brettanomyces naardenensis e Brettanomyces nanus. Nelle prime due specie sono state osservate le forme sporigene che prendono rispettivamente il nome di Dekkera bruxellensis e Dekkera anomalus.

Conclusione
Ogni risultato è la consapevolezza della propria passione
Dalle varie osservazioni su piastra il Brettanomyces che ho isolato e conservato risulta molto simile al Brettanomyces Bruxellensis).
Questa ricerca mi ha dato la possibilità di verificare e conservare dei microrganismi custoditi nel tempo da un semplice pezzo di legno. Nello specifico un vecchio pezzo di legno di un torchio da vino, proveniente all'azienda agricola Versace di Corigliano Calabro per gradita concessione dell'amico Davide Mastrangelo. L'emozione è stata molta, avere un proprio Brettanomyces a disposizione non è una cosa del tutto comune. Naturalmente come potete notare anche dalle immagini al microscopio i Brettanomyces non sono risultati gli unici microrganismi presenti nel campione iniziale. Ho trovato diverse specie batteriche e diversi Saccharomyces (selvaggi e addomesticati). Nonostante ciò ho ritenuto di conservare solo i Brettanomyces/Dekkera, aspettando di utilizzarli nelle future fermentazioni Sour.

Conservazione
Brettanomyces/Dekkera
Seguendo adeguate accortezze ho conservato
 dei campioni in congelatore.

Le condizioni igieniche perfette sono fondamentali per questo tipo di processo conservativo. E' importante essere coscienti di cosa si stia facendo, perchè una cattiva gestione potrebbe aumentare il rischio d'infezione, con le dovute conseguenze del caso (per saperne di più clicca qui).


Questa post è solo a scopo informativo, sulle mie esperienze, non mi assumo la responsabilità su ciò che farete e sui danni che potrete causare.

lunedì 22 ottobre 2018

Nuova intervista per il Giornale della Birra


Ciao amici Casalingo Brassicoli, volevo condividere con voi la mia intervista per il Giornale della Birra,  dell'autore Luciano Galea. Potete trovare l'intervista cliccando qui

Per l’intervista clicca qui
Detto questo, Buona birra a tutti!