A Caccia di Microrganismi Acidificanti

Con gli strumenti giusti è possibile catturare lieviti,

 in ogni parte, in ogni luogo.

Per dare la caccia a lieviti e batteri, le cortecce, le piante, i fiori e la frutta sono le migliori sorgenti di flora microbiologica. Dopo una prima esperienza con i lieviti (per saperne di più clicca qui) sono rimasto piacevolmente colpito dal successo ottenuto dal post, ancora oggi continua ad essere uno dei più letti e citati nel blog. Tuttavia ho iniziato una nuova e suggestiva ricerca, dove il mio interesse si è focalizzato principalmente sul legno. Sicuramente quello che si può ottenere dal legno lo si trova con più facilità nell'ambiente circostante ma i pori dei legni sono dei meravigliosi condomini, con la capacità di trasportare microrganismi anche nel tempo.

Gli ultimi mesi sono stati molto intensi, almeno dal punto di vista dell'impegno, diviso tra progetti e nuovi studi. Nonostante ciò, l'appagamento nel vivere queste intense emozioni è qualcosa di unico. Ma andiamo per ordine. Nei primi giorni di maggio il mio interesse è stato catturato dalla vista di vecchi accessori per la vinificazione. Qui in Calabria siamo pieni di storia e attrezzature sul vino, non manca occasione di trovare qualcosa di molto datato che non risponde più alle esigenze moderne. In quello stesso istante, un mio amico Vincenzo (presente anche sul gruppo Esperienze Casalingo Brassicole | HOMEBREWING CONDOR, per saperne di più clicca qui), mi ha incuriosito dicendomi: <<peccato che queste attrezzature non li possiamo usare per la birra.>>,  riferendosi in modo particolare alle botti. Proprio in quel preciso istante mi è salita l'incoscienza più totale. Se un problema non si risolve da solo, bisogna prenderlo di petto e affrontarlo. Se non esisteva modo di realizzare birre con quelle vecchie botti, potevamo trovare il modo di catturare i microrganismi presenti nei vecchi strumenti di legno. Dopo il pensiero iniziale, la consapevolezza ha fatto il resto, spostando la ricerca verso un livello più esteso. Volevo cercare la perfetta macchina del tempo, tra vecchi fienili, granai, mulini e cantine.

Una parte dell'impianto idraulico del Mulino

In breve tempo ho contattato diversi amici che potevano aiutarmi in questa ricerca. Il primo posto visionato, l'antico mulino ad acqua di Villapiana (CS), non ha dato i risultati sperati ma abbiamo volutamente preso un campione da una vecchia trave.

Quello che resta del Convento di San Francesco nell'Orto dei Monaci

Dopo una prima ricerca, non proprio esaltante, siamo passati a visionare il vecchio Convento di San Francesco, nell'Orto dei Monaci a Villapiana (CS). L'ipotesi suggestiva di entrare e vedere la cantina, chiusa da chissà quanto tempo, è rimasta solo un sogno. Successivamente grazie all'amico Davide Mastrangelo, con l'azienda agricola Versace di Corigliano Calabro, ho prelevato altri due campioni, provenienti rispettivamente dalla cantina e da un vecchio torchio vinario.

16 maggio / Primi segnali di vita

Nonostante i tanti altri posti visionati, mi restava ancora la possibilità di una antichissima cantina di mio zio, con enormi botti di rovere e molto altro ancora. La sola idea di trovare il genere Dekkera (introdotto da Van der Walt nel 1964, dopo l'osservazione al microscopio delle ascospore) mi esaltava a dismisura.

Progetto

Microrganismi Acidificanti

Se vi state chiedendo ancora cosa voglio trovare in un vecchio pezzo di legno, sappiate che l'obiettivo è quello di identificare e isolare i microrganismi acidificanti, differenziandoli tra lieviti e batteri. Tutto ciò in funzione di future birre sour. Detto ciò, questo progetto non è stato facile, il tempo dedicato è stato molto e impegnativo, senza trovare possibili scorciatoie. Grazie all'aiuto di alcuni amici ho potuto ottenere il materiale mancante al mio piccolo laboratorio (CondorLAB per saperne di più clicca qui) per la riuscita dell'intero progetto. 

Mini mosti 

Rifocillare i Microrganismi

La preparazione di questi mosti è fondamentale per l'intero progetto. Nel mio caso ho utilizzato del malto d'orzo ma si potrebbe provare anche con altri fermentabili. L'obiettivo è quello di ottenere un mosto con una densità tra 1.030 e 1.040 (per ogni litro di acqua servono, più o meno, 100 grammi di estratto). Sarebbe inoltre necessario quantificare il valore del pH del mosto, perchè potrebbe essere utile a fine fermentazione per la valutazione dei campioni.

Importante: fate particolare attenzione, tutto questo non è un gioco. Prelevare campioni con microrganismi in zone rurali, può portarvi a fermentazioni mortali, in presenza di  patogeni (clostridi, botulinum, listerie, salmonelle e ecc) e zuccheri fermentescibili. E' importante sapere che i patogeni mortali vivono in ambienti dove sono presenti animali da reddito.

Variazioni nei mosti: per cercare di minimizzare la presenza di patogeni, si potrebbe utilizzare del limone per tenere il mosto con un valore di pH  4.5. Un'altra possibile modifica potrebbe essere quella di aggiungere il luppolo, per la stessa ragione, ma non lo ritengo necessario. In ogni caso, se decidete di provare, in preparazione ricordatevi  di aggiungere al mosto una piccola quantità di luppolo in bollitura (per almeno 20 minuti). Anche se cosi facendo si esclude la presenza di batteri.

Dopo la preparazione e il successivo raffreddamento dei mosti, può essere versato e unito al campione, negli appositi contenitori di vetro (precedentemente sanitizzati).

Fermentazione

Non vedere segnali di attività fermentativa non è un problema, in tempi relativamente brevi. La fermentazione dovrebbe essere evidente dopo pochi giorni, con la presenza di piccole bolle in superficie (anidride carbonica). Nel caso contrario, con nessuna crescita e differenza di colore, lasciate i mosti per altre 48 ore. Nel giro di due settimane la fermentazione dovrebbe completarsi.

Nessuna Fermentazione

Se non si dovesse evidenziare nessuna fermentazione in superficie, dopo quattro giorni, vi consiglio di non perdere altro tempo e di buttare tutto.

Valutazione a fine fermentazione

Come prima cosa si può confrontare il ph iniziale, con quello finale. Nel caso di pH in diminuzione, in modo significativo, probabilmente  si tratta di una buona situazione. Mentre con un pH in aumento fareste meglio a scartare il mosto, anche per la vostra salute.

Test visivo: l'aspetto del mosto potrebbe darvi importanti informazioni. La sola presenza di muffe non significa che il mosto sia rovinato, mentre un mosto con una tonalità rossastra/arancio non dovrebbe essere assaggiato, anche per la vostra salute.

Test olfattivo: un odore gradevole (miele, agrumi, ecc.) sarebbe l'ideale. Mentre il mais in scatola è un aroma comune di certi lieviti selvaggi, che spesso non flocculano bene.

Test gustativo: prima di assaggiare, cercate di essere molto responsabili e rinunciate in caso di cattivi odori. Meglio buttare il campione e passare a quello successivo, senza rischiare nulla. Cosa diversa, in caso di sapori piacevoli, affrettatevi a prelevare il campione.

Crescita su Piastra

Terreni di coltura

Terreno

UBA Agar modificato

Risulta una buona base per una crescita generica. Nella preparazione del terreno, l'aggiunta di birra riduce la presenza microbica favorendo quelli che si sono adattati al luppolo ed alcol. Naturalmente l'utilizzo della birra è assolutamente facoltativo e non indispensabile. 

5,5 g di Terreno UBA
75 ml Acqua Distillata
25 ml di Birra (non sgasata)

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA e acqua distillata nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare la condensa, la parte del vetrino superiore deve essere lasciata aperta. In laboratorio si fanno asciugare sotto la cassa a flusso laminare, evitando contaminazioni, mentre tra le mura di casa il rischio è molto alto. Personalmente preferisco utilizzare la cappa dello sterilizzatore (quello della chicco) con il Bunsen, con il quale non ho riscontrato problemi di contaminazione, solo in due singole occasioni dove avevo commesso errori precedenti.

Diversamente se si vuole avere un approccio più casalingo verso la preparazione e gli stessi ingredienti, il libro Handbook of Microbiological Media di Ronald M. Atlas ci regala buone alternative molto economiche. Questo testo include differenti ricette che possono essere realizzate tranquillamente tra le mura di casa.

Terreno Alternativo

Potato Dextrose Agar

Perfetto per coltivare qualsiasi cosa.

Patate 300 gr

Glucosio o Saccarosio (zucchero da tavola) 20 gr

Agar 15 gr

Preparazione: tagliare le patate a dadini e metterle in 500 ml di acqua bollente, per 30 minuti. Tramite una garza il composto viene  filtrato, regolando il volume  su un litro con acqua distillata/deionizzata. Successivamente serve mescolare accuratamente aggiungendo l'agar al composto. Riscaldare il tutto a fuoco lento, portando ad ebollizione, aggiungendo 20 gr di glucosio e mescolando accuratamente. Passaggio in autoclave per 15 minuti a (15 psi di pressione) a 121 °C. Terminato questo passaggio, versare il Potato Dextrose Agarin nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Una volta scelti i campioni migliori, le probabilità di avere diversi ceppi di lievito, muffe e batteri, sono considerevoli. Dunque, per cercare di isolare i diversi microrganismi occorre utilizzare specifiche piastre di Petri e agar.

Crescita su Piastra

Terreni Selettivi

Questi particolari terreni favoriscono la crescita solo di specifici microrganismi, grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. Questi fattori vengono chiamati sostanze inibenti,  come ad esempio gli antibiotici. Detto questo, per isolare i diversi microrganismi presenti nei campioni iniziali, occorre avere o creare dei terreni selettivi. Un argomento sicuramente molto interessante con molteplici soluzioni, dettate principalmente dalle pratiche che più si adatta meglio alle proprie esigenze. Personalmente ho deciso di iniziare con queste differenti ricette di terreni selettivi, evitando l'acquisto di un terreno già bello e pronto.

Test sui Batteri

UBA Agar modificato con Cicloesimide

L'aggiunta di Cicloesimide, al terreno UBA Agar modificato, agevola l'eliminazione dei lieviti presenti nel campione, favorendo una migliore ricerca sulle contaminazioni batteriche. 

5,5 g di Terreno UBA

75 ml Acqua Distillata

25 ml di Birra (non sgasata)

0,001 gr/litro di Cicloesimide

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA, acqua distillata e cicloesimide nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Test sui Batteri Lactobacillus e Pediococcus 

Terreno HLP

L'Hsu's Lactobacillus e Pediococcus è un terreno utilizzato favorire la presenza proprio di Lactobacillus e Pediococcus, nello specifico acido lattico Gram +.

7 gr di Terreno HLP

2 gr di Agar

100 ml Acqua Distillata

Preparazione:  Aggiungere il terreno HLP, acqua distillata e ager nella beuta. Risulta importantissimo l'utilizzo di occhiali, schermo facciale e guanti, per proteggersi durante l'utilizzo dell'HLP. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione,  chiudendo prima la beuta con del cotone permeabile. Successivamente raffreddare il terreno fino a temperatura di 45 °C, versando poi 17 ml di terreno e 1 ml di campione, per ogni provetta. Utilizzare provette sterili con tappo avvitabile da 16X150 mm. Portate le provette a 30 °C per 48/60 ore, in un'incubatrice. Lactobacillus si presenteranno come colonie bianche a forma di lacrima capovolta metre i Pediococcus di forma sferica con colonie bianche.

Test sui Brettanomyces

Brettanomyces Agar

Crescita specifica di specie Brettanomyces.

5,0 gr di Destrosio

2,5 gr di Bacto-Peptone

1,5 gr di Estratto di Malto

1,5 gr di Estratto di Lievito

1,5 gr di base Azotata di Lievito (YNB)

0,5 gr di Cloramfenicolo

0,011 gr di Verde di Bromocresolo

0,01 gr di Tiamina

0,05 gr di Acido P-Cumarico

Cicloesimide a 0,01 gr / L

10 gr di Agar

Queste quantità sono per 500 ml

Questo terreno favorisce la crescita specifica delle specie Brettanomyces, dove la molecola dell''acido p-cumarico viene convertita in 4-etilfenolo dai Brettanomyces, producendo l'odore classico da Brett. Proprio per questo le colonie possono essere identificate dall'odore.

Terreno Alternativo

Potato Dextrose Agar 
Con aggiunte alternative

Patate 300 gr

Glucosio o Saccarosio (zucchero da tavola) 20 gr

Agar 15 gr

Aggiunte possibili
 a. Antibiotico
b. Antibiotico, Acido Lattico e Verde di Bromocresolo.
c. Antifungino, Succo di Mela e Saccarosio.

Preparazione: Tagliare le patate a dadini e metterle in 500 ml di acqua bollente, per 30 minuti. Tramite una garza il composto viene  filtrato, regolando il volume  su un litro con acqua distillata/deionizzata. Successivamente serve mescolare accuratamente aggiungendo l'agar al composto. Riscaldare il tutto a a fuoco lento, portando ad ebollizione, aggiungendo 20 gr di glucosio e mescolando accuratamente. Passaggio in autoclave per 15 minuti a (15 psi di pressione) a 121 °C. Terminato questo passaggio, versare il Potato Dextrose Agarin nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

a. Per isolare i lieviti bisogna aggiungere alla base di Potato Dextrose Agar un antibiotico, per inibire i batteri.

b. Per isolare i Brettanomyces può essere l'aggiunto al Potato Dextrose Agar un antibiotico (per inibire i batteri) e acido lattico o succo di limone, per abbassare il pH a 3 e inibire gli altri lieviti. Mentre per favorire la differenziazione dei Brettanomyces serve del Verde di bromocresolo.

c. Per isolare dei batteri l'ideale sarebbe utilizzare un antimicotico o antifungino. Per i Lactobacillus si potrebbe aggiungere una parte di succo di mela e saccarosio (zucchero da tavola) al posto del glucosio per consentire la differenziazione. I Lactobacillus crescono come piccole colonie mentre il saccarosio gli consente di formare grandi colonie.

Strisciare una Piastra

Strisciare una piastra non risulta una cosa difficile, utilizzando un'ansa da inoculo (precedentemente sterilizzata) bisogna solamente immergerla in una fonte di campione e passarla successivamente sulla superficie di agar (per saperne di più clicca qui).

Prelevare e Trasferire le Colonie da una Piastra
Individuare e prelevare le colonie, da una piastra, non risulta una cosa difficile. L'intero processo inizia con la verifica della crescita, nella prima area strisciata si dovrebbe notare una crescita maggiore, con una coltura di lievito densa, mentre la crescita continua scemando verso la parte finale dello striscio (per saperne di più clicca qui).

Oltre all'utilizzo del libro "Handbook of Microbiological Media" di Ronald M. Atlas, ho consultato per le ricette dei terreni anche il libro "Il lievito" di  Chris White, Jamil Zainasheff.

Osservazione al Microscopio

Osservazione tramite microscopio della morfologia dei lieviti, 

con la replicazione per gemmazione.

Foto in alto, nel colore giallo è chiaramente visibile la singola cellula di Saccharomyces, dal nucleo alle membrane, cellulare e nucleare. Nel colore verde si vede l'inizio della fase di divisione, dove i cromosomi sono attaccati a una struttura chiamata corpo polare del fuso, che si duplica dando inizio alla divisione. Mentre nel cerchio rosso si sta per concludere la divisione cellulare. I cromosomi sono già separati, arrivati nella gemma, per formare il corredo genetico della nuova cellula figlia (per saperne di più clicca qui).

Le cellule de Brettanomyces sono di dimensione media (2.0-5.5 per 3.0-22.0) e si presentano  sferoidali, ellissoidali, spesso ogivali o cilindroidi per allungarsi. Le cellule assumono molte forme, tra cui singole, coppie, catene corte e cluster. Generalmente formano un Pseudomicelio ramificate e si può formare un micelio non settato a cellule singole. La separazione incompleta porta ad alcune catene. Generalmente il nome Dekkera viene usato intercambiabilmente con Brettanomyces, dato che descrive la telemorfosi o forma delle spore del lievito. La morfologia delle spore è da uno a quattro, a forma sferoidale, con ascospore tangenti.

Brettanomyces: forma asessuale, non sporigena

Dekkera: forma sessuale, sporigena.

Il genere Brettanomyces/Dekkera include cinque specie:
Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus; Brettanomyces naardenensis e Brettanomyces nanus. Nelle prime due specie sono state osservate le forme sporigene che prendono rispettivamente il nome di Dekkera bruxellensis e Dekkera anomalus.

Conclusione

Ogni risultato è la consapevolezza della propria passione

Dalle varie osservazioni su piastra il Brettanomyces che ho isolato e conservato risulta molto simile al Brettanomyces Bruxellensis).

Questa ricerca mi ha dato la possibilità di verificare e conservare dei microrganismi custoditi nel tempo da un semplice pezzo di legno. Nello specifico un vecchio pezzo di legno di un torchio da vino, proveniente all'azienda agricola Versace di Corigliano Calabro per gradita concessione dell'amico Davide Mastrangelo. L'emozione è stata molta, avere un proprio Brettanomyces a disposizione non è una cosa del tutto comune. Naturalmente come potete notare anche dalle immagini al microscopio i Brettanomyces non sono risultati gli unici microrganismi presenti nel campione iniziale. Ho trovato diverse specie batteriche e diversi Saccharomyces (selvaggi e addomesticati). Nonostante ciò ho ritenuto di conservare solo i Brettanomyces/Dekkera, aspettando di utilizzarli nelle future fermentazioni Sour.

Conservazione

Brettanomyces/Dekkera

Seguendo adeguate accortezze ho conservato

 dei campioni in congelatore.

Le condizioni igieniche perfette sono fondamentali per questo tipo di processo conservativo. E' importante essere coscienti di cosa si stia facendo, perchè una cattiva gestione potrebbe aumentare il rischio d'infezione, con le dovute conseguenze del caso (per saperne di più clicca qui).

Questa post è solo a scopo informativo, sulle mie esperienze, non mi assumo la responsabilità su ciò che farete e sui danni che potrete causare.