A caccia di lieviti

Con gli strumenti giusti è possibile catturare lieviti,

 in ogni parte, in ogni luogo.

Con questo post, cercherò di riportare tutti i passaggi che mi hanno portato sulle tracce dei lieviti. Un progetto che si sofferma territorialmente, sulla mia fattoria. Un tentativo casalingo, per molti pessimo ma personalmente entusiasmante. Nonostante la passione e la dedizione, la caccia ai lieviti risulta un argomento particolarmente difficile e complesso.

Lieviti autoctoni o selvaggi
Molto spesso queste due definizioni vengono impropriamente usate come sinonimi, anche se la  differenza è grande. Con il termine autoctono si indica solamente un ceppo selvaggio che viene isolato, senza specificare i processi di selezione (naturale o domestica). Mentre con il termine selvaggi si indica ceppi selvaggi, che danno vita alla fermentazione spontanea, in assenza di inoculo artificiale.

Detto questo, il mio obiettivo finale è quello di isolare un lievito autoctono  ma allo stesso tempo arrivare alla fermentazione spontanea, aggirando la regole.

Mini mosti 

Trappola per lieviti

La preparazione di questi mosti è fondamentale. Nel mio caso ho utilizzato del malto d'orzo ma si potrebbe provare anche con altri fermentabili. L'obiettivo è quello di ottenere un mosto con una densità tra 1.030 e 1.040 (per ogni litro di acqua servono, più o meno, 100 grammi di estratto). Sarebbe inoltre necessario quantificare il valore del pH del mosto, perchè potrebbe essere utile a fine fermentazione, per la valutazione dei campioni.

Variazioni nei mosti
Per cercare di minimizzare la presenza di patogeni, si potrebbe utilizzare del limone per tenere il mosto con un valore di pH  4.5. Un'altra possibile modifica potrebbe essere quella di aggiungere il luppolo, per la stessa ragione, ma non lo ritengo necessario. In ogni caso, se decidete di provare, in preparazione ricordatevi  di aggiungere al mosto una piccola quantità di luppolo in bollitura (per almeno 20 minuti).

Preparati i mini mosti e versato il contenuto negli appositi contenitori di vetro (precedentemente sanitizzati). Per evitare possibili insetti, sarebbe opportuno coprire con una garza (sterile) le aperture.

Come e quando posizionare le trappole
Ipoteticamente si dovrebbe posizionare i mosti nel tardo pomeriggio o di sera, quando il caldo del giorno ormai è andato via. E' preferibile evitare i mesi caldi e quelli troppo freddi. Nel mio caso, nonostante il sole, la temperatura toccava i 14 °C.

Dove posizionare le trappole 
Naturalmente all'aperto, anche se non è una regola, è consigliabile una zona di alberi da frutta (per gli zuccheri naturali). Un posto fresco, ventilato e con una buona vegetazione, indisturbato da animali e persone. La mia campagna riveste in pieno queste caratteristiche.

Ritirare le trappole
Il giorno successivo, dopo 15 ore circa, dalle ore 16 del pomeriggio ho ritirato i barattoli. Generalmente i mosti vano ritirati dopo 12 ore e portati in un luogo poco luminoso, a temperatura ambiente.  Rimuovete le garze e coprite successivamente, per evitare il contatto del mosto con l'aria.

Fermentazione
Non vedere segnali di attività fermentativa non è un problema, in tempi relativamente brevi. La fermentazione dovrebbe essere evidente dopo pochi giorni, con la presenza di piccole bolle in superficie (anidride carbonica). Nel caso contrario, con nessuna crescita e differenza di colore, lasciate i mosti per altre 48 ore. Nel giro di due settimane la fermentazione dovrebbe completarsi.

Nessuna Fermentazione
Se non si dovesse evidenziare nessuna fermentazione in superficie, dopo quattro giorni, vi consiglio di fare un nuovo tentativo di raccolta, con lo stesso campione.

Valutazione a fine fermentazione
Come prima cosa si può confrontare il ph iniziale, con quello finale. Nel caso di pH in diminuzione, in modo significativo, probabilmente  si tratta di una buona situazione. Mentre con un pH in aumento fareste meglio a scartare il mosto.

Test visivo: l'aspetto del mosto potrebbe darvi importanti informazioni. La sola presenza di muffe non significa che il mosto sia rovinato, mentre un mosto con una tonalità rossastra/arancio non dovrebbe essere assaggiato.

Test olfattivo: un odore gradevole (miele, agrumi, ecc.) sarebbe l'ideale. Mentre il mais in scatola è un aroma comune di certi lieviti selvaggi, che spesso non flocculano bene.

Test gustativo: prima di assaggiare, cercate di essere molto responsabili e rinunciate in caso di cattivi odori. Meglio buttare il campione e passare a quello successivo, senza rischiare. Cosa diversa, in caso di sapori piacevoli, affrettatevi a prelevare il campione.

Una volta scelti i campioni, passate i barattoli in frigo per 24 ore, in modo  da elimina la parte liquida e recuperare quella semi solida, mediante provetta sterile. Arrivati a questa fase, il programma si divide, stessi campioni ma distinti progetti (vedi foto sopra).

___________________________________

 Progetto "A"

Strisciare una Piastra 

Nonostante la fermentazione e la scrematura dei campioni, le probabilità di catturare diversi ceppi di lievito, muffe e batteri, sono alte. Dunque per cercare di isolare un ceppo di lievito, vi occorre utilizzare le piastre di Petri e agar.

Nel mio caso, ho utilizzato delle piastre di Petri (monouso) contenenti già dell'agar. Conservate precedentemente in frigorifero, con la superficie di agar verso il basso.

Strisciare una piastra non risulta una cosa difficile, utilizzando un'ansa da inoculo (precedentemente sterilizzata) bisogna solamente immergerla in una fonte di lievito e passarla successivamente sulla superficie di agar. Questa tecnica prevede movimenti ampi sulla piastra in modo da disperdere le varie cellule, presenti sull'ansa, e tenere lontano le ultime cellule tra loro, in modo che una singola cellula possa avere spazio sufficiente per formare una colonia isolata.

Strisciare una Piastra 
Procedimento
1. Lavate e pulite il tavolo di lavoro, con alcol etilico.
2. Per sicurezza aspettate qualche minuto e accendete una fiamma. La soluzione più semplice è una lampada ad alcol, anche se risulta molto meglio utilizzare un becco di bunsen. La massa d'aria che sale di quota dalla fiamma (conosciuta come corrente ascensionale) da origine alla zona pulita dove possiamo lavorare in sicurezza.

3.  Prendete l'ansa e la piastra, ancora chiusa, per adagiarli nell'aria di lavoro sicura. La superficie di agar deve essere verso il basso, come avviene durante la conservazione.
4. Posate il porta provette con la relativa provetta di campione, nella stessa aria di lavoro, e apritela.
5. Utilizzate dei guanti monouso.
6. Aprite la piastra e girate verso l'alto, la superficie di agar.
7. Sterilizzate l'ansa sotto la fiamma. Per raffreddarla, in tempi utili, toccate la superficie di agar con l'anello.
8. Con la stessa ansa, immergete parzialmente l'anello per prelevare una parte di campione, presente nella provetta. Basta solo una minima parte.

9. Rimanete con l'ansa nell'aria pulita, per passare con l'anello sulla piastra. Strisciate avanti e indietro, in una piccola sezione dell'ager. Successivamente, ruotate la piastra, di 90 gradi, e strisciate una nuova sezione. Ripetete il tutto (vedi foto sopra) ricordando che servono poche cellule di lievito, altrimenti è impossibile selezionare una cellula singola.

10. Successivamente potete posare ansa, per richiudere la piastra, avendo cura di rimanere nell'aria sicura.

Crescita in Piastra
In questa fase, differentemente da quella di conservazione, le piastre devono essere poste con la superficie di agar verso l'alto. Successivamente è utile lasciare la piastra in una Mini Incubatrice (per il fai da te clicca qui), per circa 60 ore, alla temperatura di 22 °C.

Verifica della Crescita
Nella prima area strisciata, della piastra, potrete notare una crescita maggiore, con una coltura di lievito densa. Questa stessa crescita andrà scemando, sempre di più, verso la parte finale dello striscio.

Nessuna Cultura Isolata
Nell'eventualità di inesistenti colture isolate, l'intera fase dello striscio, deve essere ripetuta con una nuova piastra.

Crescita Adeguata

Propagazione dalla Piastra

Inoculo Selettivo

La giusta scelta delle colonie è alla base del progetto. Una fase dove, generalmente, si presta più attenzione delle altre. Detto questo, fareste meglio a capire che ogni sbaglio si paga, differentemente dalla fase in cui viene fatto. Una disattenzione, anche minima, può essere deleteria per il risultato finale, condizionando anche eventuali riferimenti documentati. Ricordatevi di prestare attenzione, in ogni minima situazione dell'intero progetto.

In questa specifica fase soffermatevi con attenzione sulle colonie di lievito, in una posizione di ottima luminosità. Valutate e guardate i due lati della piastra, individuando anche possibili zone anomale.

Individuare

Muffe

La muffa è solitamente evidente come una cresta soffice e pelosa (simile a quella di pane, formaggio e frutta). Può apparire anche come una sostanza trasparente e disordinata, anche per questo non risulta semplice da vedere, in questi specifici casi. In caso di muffa, bisognerebbe iniziare da un'altra piastra, mentre se si desidera continuare con la stessa piastra contaminata, la cultura selezionata deve essere strisciata nuovamente su una nuova piastra.

Individuare

Batteri

Risulta difficile l'individuazione di batteri, perchè possono apparire come delle colonie di lievito. Generalmente possono essere traslucidi e nel caso anche colorate. Anche per questo le colonie lucide sono indicatori di una possibile infezione batterica.

Individuare

Lieviti Selvaggi

Solitamente possono apparire come delle colonie deformate.

Individuare

Colonie di Lievito

Appaiono come dischi rotondi con una punta al centro. Pannosi e di colore biancastro o lattiginoso (marrone, carta da pacchi).

Prelevare e Trasferire

Colonie di Lievito

Il trasferimento delle colonie deve essere fatto in un terreno sterile, di 15 millilitri (Chris White nel libro "Il Lievito" consiglia di iniziare tra i 10 e 25 millilitri). L'obiettivo è quello di ottenere un terreno con una densità di 1.020 SG. Solo successivamente alla prima crescita è possibile usare un terreno con densità di 1.040 (per ogni litro di acqua servono, più o meno, 100 grammi di estratto). In questa specifica fase, il primo passo è quello di evitare shock termici al lievito. Lasciate il terreno sterile a temperatura ambiente, in modo da garantire al lievito una temperatura similare con il terreno di crescita.

Per garantire e mantenere una diversità genetica è indispensabile scegliere più di una colonia, per iniziare una coltura. Sarebbe utile scegliere, più o meno, 10 colonie individuali.

1 colonia contiene almeno 1 milione di cellule,

generate dalla stessa cellula madre.

Le colonie scelte devono essere di media grandezza, evitate quelle grandi o piccole. Selezionando le colonie tra i 3 e i 5 mm di grandezza.

Dopo la scelta delle colonie da trasferire e il successivo inoculo nel terreno sterile, bisogna lasciare i contenitori (il coperchio deve essere lievemente svitato) in una Mini Incubatrice (per il fai da te clicca qui), per circa 60 ore, alla temperatura di 22 °C.

Conservazione
(piastra con colonie)

Dopo una buona crescita su piastra è possibile conservare i campioni. Prima di passare alla conservazione in frigorifero, bisogna adeguatamente sigillare l'apertura della piastra, con del nastro isolante (in vinile).

Lievito Ale o Lager?

Identificazione

Ottenuto un lievito autoctono potete decidere di proseguire il progetto "A" con più certezze, prima della prova di fermentazione (nel mio caso ho deciso di utilizzare solo il campione 2). Non sapendo di che tipo di lievito si tratta potete differenziare il lievito. Generalmente per distinguere i ceppi ale e lager si ricorre alla crescita con Melibiosio (un disaccaride) o a temperatura di 37 °C. Nel mio caso ho deciso di ricorrere al metodo della crescita a 37 °C. I lieviti Ale dimostrano una maggiore flessibilità alle diverse temperature, mentre i Lager non riescono a crescere alla temperatura di 37 °C. Tramite il trasferimento del lievito (semina) e la mini incubatrice potete facilmente ottenuto la risposta a questa domanda. 

Procedimento

1. Lavate e pulite il tavolo di lavoro, con alcol etilico.

2. Per sicurezza aspettate qualche minuto e accendete una fiamma. La soluzione più semplice è una lampada ad alcol, anche se risulta molto meglio utilizzare un becco di bunsen. La massa d'aria che sale di quota dalla fiamma (conosciuta come corrente ascensionale) da origine alla zona pulita dove possiamo lavorare in sicurezza.

3. Successivamente strisciate 4 diverse piastre di Petri con lo stesso campione (clicca qui per vedere come strisciare una piastra).

4. In questa fase mettete 2 delle piastre  in una incubatrice (clicca qui per conoscere come costruirla) a 37 °C, mentre le restanti piastre in un'altra incubatrice a 25 °C. Le piastre devono essere poste con la superficie di agar verso l'alto e lasciate nell'incubatrice per 3 giorni.

Risultati della mia crescita

25 °C   Lager (crescita) Ale (crescita)

37 °C   Lager (nessuna) Ale (crescita)

Dunque, alla luce dei risultati ottenuti ho isolato un ceppo di lievito Ale. Dopo questa certezza, il passo successivo è stato quello di congelare una parte del lievito e l'altra utilizzata per una prova di fermentazione.

Prove di Fermentazione

Questa fase del progetto prosegue con una fermentazione in laboratorio, per testare il lievito autoctono. Una fermentazione di 1,5 litri di mosto, bollito e luppolato. Utilizzando questo volume potete tranquillamente ottenuto diverse analisi della fermentazione, con misurazioni quotidiane di densità.

La mia fermentazione

Mosto Pale 100% 

Luppolo Northern Brewer (solo in amaro)

Mono Step a 66 °C

OG 1045

FG 1009

Temperatura di fermentazione C° 19

Attenuazione Apparente 80%

Attenuazione Reale 65%

Flocculazione Bassa

Nel mio caso ho ottenuto un lievito poco caratterizzante, anche se mi  riservo di dare giudizi definitivi, prima di utilizzarlo a temperature di fermentazione differenti.

Consiglio finale

Per ottenere un riscontro migliore sarebbe utile utilizzare diverse temperature di fermentazione. Ritengo indispensabile creare un'accurata raccolta dati, con la documentazione di tutti gli aspetti.

Il mio lievito autoctono

___________________________________

Progetto "B"

Prove di Fermentazione Spontanea

La fermentazione spontanea è un nuovo modo di vedere e concepire la birra. Il mosto viene fatto fermentare liberamente, in vasche aperte, dove la gestione dell'uomo è nulla o quasi. Questa fermentazione è un miracolo della natura. Ipoteticamente, in modo del tutto riduttivo, questa stessa fase iniziale è toccata ai miei campioni, nei barattoli. I lieviti e gli altri microrganismi, presenti nell'aria, tramite il naturale contatto con il mosto, hanno dato i suoi risultati. Questi particolari risultati, dopo la propagazione del campione scelto (con starter ma senza agitatore magnetico. L'ossigenazione continua per la crescita di una coltura mista favorisce i lieviti ma non fornisce aiuti alle cellule batteriche) mi hanno spinto verso una fermentazione in laboratorio, per testare il campione in una birra vera e propria.

Inoculo e Fermentazione

Procedimento

1. Portate a temperatura ambiente lo starter del campione (senza l'uso dell'agitatore), precedentemente realizzato.

2. Preparate un mosto di 5 litri, bollito e luppolato (con 6 gr/l di luppolo invecchiato di 2 anni). Sarebbe preferibile un mosto poco caratterizzante.

3. Raffreddate il mosto.

4. Raccogliete il sedimento dallo starter e inoculate, nel mosto.

5. Ossigenate il mosto.
6. Fermentate a temperature non superiore i 22 °C

La mia esperienza

I risultati della fermentazione spontanea, nella prova di fermentazione, non mi hanno dato i risultati sperati. Anche se siamo su tempi relativamente brevi, il primo assaggio non è stato molto piacevole ma diamo tempo al tempo e speriamo bene. Il campione scelto per questa fermentazione è stato il solo campione numero 2, inoculato in 5 litri di mosto, bollito e luppolato. Ho deciso di apportare qualche modifica, all'idea iniziale del progetto, utilizzando luppolo invecchiato.

Questa post è solo a scopo informativo, sulle mie esperienze, non mi assumo la responsabilità su ciò che farete e sui danni che potrete causare.