Terreni di Coltura

Generalmente per terreni di coltura si intende una soluzione solida o liquida, contenente sostanze nutritive per la crescita e la ricerca microbica. 

Crescita su Piastra

UBA Agar modificato

Risulta una buona base per una crescita generica. Nella preparazione del terreno, l'aggiunta di birra riduce la presenza microbica favorendo quelli che si sono adattati al luppolo ed alcol. Naturalmente l'utilizzo della birra è assolutamente facoltativo e non indispensabile. 

5,5 g di terreno UBA
75 ml acqua distillata
25 ml di birra (non sgasata)

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA e acqua distillata nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la di birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare la condensa, la parte del vetrino superiore deve essere lasciata aperta. In laboratorio si fanno asciugare sotto la cassa a flusso laminare, evitando contaminazioni, mentre tra le mura di casa il rischio è molto alto. Personalmente preferisco utilizzare la cappa dello sterilizzatore (quello della chicco) con il Bunsen, con il quale non ho riscontrato problemi di contaminazione, solo in due singole occasioni dove avevo commesso errori precedenti.

Terreno Alternativo

Sabouraud Agar

Questo terreno risulta un'ottima alternativa all' UBA Agar modificato, per una crescita microbica generica.

20 gr di Destrosio

10 g di Agar

5 g di Bacto Peptone

pH di 5,6
Acqua distillata

Queste quantità sono per 500 ml

Diversamente se si vuole avere un approccio più casalingo verso la preparazione e gli stessi ingredienti, il libro Handbook of Microbiological Media di Ronald M. Atlas ci regala buone alternative molto economiche. Questo testo include differenti ricette che possono essere realizzate tranquillamente tra le mura di casa.

Terreno Alternativo

Potato Dextrose Agar

perfetto per coltivare qualsiasi cosa

Patate 300 gr

Glucosio o Saccarosio (zucchero da tavola) 20 gr

Agar 15 gr

Preparazione: tagliare le patate a dadini e metterle in 500 ml di acqua bollente, per 30 minuti. Tramite una garza il composto viene  filtrato, regolando il volume  su un litro con acqua distillata/deionizzata. Successivamente serve mescolare accuratamente aggiungendo l'agar al composto. Riscaldare il tutto a fuoco lento, portando ad ebollizione, aggiungendo 20 gr di glucosio e mescolando accuratamente. Passaggio in autoclave per 15 minuti a (15 psi di pressione) a 121 °C. Terminato questo passaggio, versare il Potato Dextrose Agarin nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Una volta scelti i campioni migliori, le probabilità di avere diversi ceppi di lievito, muffe e batteri, sono considerevoli. Dunque, per cercare di isolare i diversi microrganismi occorre utilizzare specifiche piastre di Petri e agar.

Crescita su Piastra

Terreni Selettivi

Questi particolari terreni favoriscono la crescita solo di specifici microrganismi, grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. Questi fattori vengono chiamati sostanze inibenti,  come ad esempio gli antibiotici. Detto questo, per isolare i diversi microrganismi presenti nei campioni iniziali, occorre avere o creare dei terreni selettivi. Un argomento sicuramente molto interessante con molteplici soluzioni, dettate principalmente dalle pratiche che più si adatta meglio alle proprie esigenze. Personalmente ho deciso di iniziare con queste differenti ricette di terreni selettivi, evitando l'acquisto di un terreno già bello e pronto.

Test sui Lieviti

Sabouraud Agar con Cloramfenicolo

Questo terreno risulta ottimo per una crescita dei lieviti.

Partendo dal terreno Sabouraud Agar ho aggiunto 0,25 gr di Cloramfenicolo, un forte antibiotico antimicrobico progettato per uccidere i batteri Gram + e Gram −.

MYPG + CuSO4 medium

utile a differenziare i Saccharomyces dai ceppi selvatici di Saccharomyces

1,5 gr di estratto di malto

1,5 gr di estratto di lievito

5,0 gr di glucosio

2,5 gr di Bacto Peptone

0,156 gr di CuSO4 - 5 H2O

pH di 6,2

Queste quantità sono per 500 ml

Il terzo media differenziale che ho usato era il media CuSO4 MYPG. Solfato di rame viene generalmente utilizzato per differenziare tra Saccharomyces e ceppi selvatici di Saccharomyces , non Brettanomyces. Anche se, Chad Yakobson di Crooked Stave ha avuto un po 'di fortuna con la crescita di Brett su lastre di CuSO4.

Test sui Brettanomyces

Brettanomyces Agar

fa crescere specificatamente le specie Brettanomyces

5,0 gr di destrosio

2,5 gr di Bacto-peptone

1,5 gr di estratto di malto

1,5 gr di estratto di lievito

1,5 gr di base azotata di lievito (YNB)

0,5 gr di cloramfenicolo

0,011 gr di verde di bromocresolo

0,01 gr di tiamina

0,05 gr di acido p-cumarico

Cicloesimide a 0,01 gr / L

10 g di Agar

Queste quantità sono per 500 ml

Infine ho realizzato Brettanomyces Agar . Ho trovato questa ricetta nel manuale dei lieviti alimentari . Questa formulazione fa crescere specificatamente le specie Brettanomyces . È interessante notare che ho aggiunto l'acido p-cumarico (per gentile concessione della Brooklyn Brewery). Questa molecola viene convertita in 4-etilfenolo da Brettanomyces e produce il classico odore di Brett: coperta di cavallo, aia e mousy. Le colonie possono essere identificate dall'odore.

Test sui Batteri

UBA Agar modificato con Cicloesimide

L'aggiunta di con Cicloesimide, al terreno UBA Agar modificato, agevola l'eliminazione dei lieviti presenti nel campione, favorendo una migliore ricerca sulle contaminazioni batteriche. 

5,5 g di terreno UBA

75 ml acqua distillata

25 ml di birra (non sgasata)

0,001 gr/litro di Cicloesimide

Preparazione:  Aggiungere il terreno UBA, acqua distillata e cicloesimide nella beuta. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (per un minuto),  chiudendo prima la beuta con del cotone. Successivamente con il terreno ancora caldo si può aggiungere la di birra (non sgasata). La sterilizzazione in autoclave deve durare 10 minuti, a circa 120 °C. Non bisogna andare oltre questo tempo e temperatura per non danneggiare il terreno. Terminato questo passaggio, versare l'UBA Agar modificato nelle piastre di Petri sterili. Lasciare asciugare bene la superficie del terreno in piastra prima della semina. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Test sui Batteri Lactobacillus e Pediococcus 

Terreno HLP

L'Hsu's Lactobacillus e Pediococcus è un terreno utilizzato favorire la presenza proprio di Lactobacillus e Pediococcus, nello specifico acido lattico Gram +.

7 gr di terreno HLP

2 gr di Agar

100 ml acqua distillata

Preparazione:  Aggiungere il terreno HLP, acqua distillata e ager nella beuta. Risulta importantissimo l'utilizzo di occhiali, schermo facciale e guanti, per proteggersi durante l'utilizzo dell'HLP. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione,  chiudendo prima la beuta con del cotone permeabile. Successivamente raffreddare il terreno fino a temperatura di 45 °C, versando poi 17 ml di terreno e 1 ml di campione, per ogni provetta. Utilizzare provette sterili con tappo avvitabile da 16X150 mm. Portate le provette a 30 °C per 48/60 ore, in un'incubatrice. Lactobacillus si presenteranno come colonie bianche a forma di lacrima capovolta mentre i Pediococcus di forma sferica con colonie bianche.

Test sui Batteri Lactobacillus

MRS Agar with Tween® 80

Terreno in polvere indicato per la coltivazione e l’isolamento dei lattobacilli. Il sodio acetato e l’ammonio citrato intensificano la crescita dei lattobacilli, mentre il magnesio solfato è inserito per motivi precauzionali poichè l’estratto di lievito dovrebbe fornire una quantità di magnesio sufficiente alla loro crescita.

70,2 g di MRS Agar o 55,2 g di MRS Broth 

1000 ml di acqua distillata fredda

Preparazione: Aggiungere il terreno e l'acqua fredda distillata nella beuta. Risulta importantissimo l'utilizzo di occhiali, schermo facciale e guanti, per proteggersi durante l'utilizzo dell'HLP. Tramite agitazione continua e costante serve portare il tutto ad ebollizione (in autoclavare a 121°C per 15 minuti), chiudendo prima la beuta con del cotone permeabile. Successivamente raffreddare il terreno fino a temperatura di 45 °C, versando poi 10/15 ml di terreno e 1 ml di campione, per ogni provetta. Utilizzare provette sterili con tappo avvitabile da 16X150 mm. In funzione del tipo Lactobacillus e di ricerca da eseguire incubare tra i 35 °C e i 42°C per 48 ore, mentre per i soli lattobacilli psicrofili 25°C per 5 giorni. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Per il conteggio dei Lactobacillus Bulgaricus nello yogurt seminare 1 mL delle diluizioni decimali del campione in piastre sterili. Addizionare 15 ml di MRS Agar acidificato a pH 5,4 (consiglio l’uso di acido acetico), lasciare solidificare ed incubate a 37°C in anerobiosi per 72 ore. Durante questa fase sarebbe opportuno evitare contaminazioni e condensa.

Questo post è solo a scopo informativo, sulle mie esperienze, non mi assumo la responsabilità su ciò che farete e sui danni che potrete causare.